瓊脂中克隆培養(yǎng)

時(shí)間：2022/12/13閱讀：1083

原理

溫度高時(shí)瓊脂呈液態(tài)，但在37℃ 時(shí)成凝膠狀態(tài)，細(xì)胞懸浮在溫暖的瓊脂凝膠培養(yǎng)基中,，待瓊脂形成凝膠后進(jìn)行培養(yǎng),，形成散在集落，很容易分離,。

材料與儀器

Noble瓊脂 Difco 胎牛血清
兩倍濃度培養(yǎng)基生長培養(yǎng)基無菌超純水無菌錐形瓶吸管通用容器培養(yǎng)皿水浴三角瓶托盤電子細(xì)胞計(jì)數(shù)儀本生煤氣噴燈

步驟

1. 在培養(yǎng)皿底皿側(cè)面編號(hào)或做好標(biāo)記,，將培養(yǎng)皿放在托盤中，很方便,。

2. 準(zhǔn)備含 40 % FBS 的 2× 培養(yǎng)基（即 Ham’SF12,、RPMI1640、DMEM 或 CMRL1066,。用 10×培養(yǎng)基配 2× 培養(yǎng)基,，取半量所需終液量，加兩倍濃度的血清）,，保持 37℃,。

3. 稱取 1.2 g 瓊脂。

4. 分別在無菌錐形瓶和另一個(gè)無菌瓶中加 100 ml 無菌 UPW,。將 1.2 g 瓊脂放人錐形瓶中,，蓋好，煮沸 2 min ,。另一種方法是,，提前高溫滅菌瓊脂。但若已保存起來,，使用時(shí)仍需煮沸溶解或微波爐融化備用,。

5. 將煮沸過的瓊脂和有 UPW 的瓶放到 55°C 水浴中。

6. 2× 培養(yǎng)基和 1.2 % 瓊脂等量混合制備 0.6 % 瓊脂底層,，保持 37°C ,。如果需要任何的生長因子、激素或其他添加物,，應(yīng)在此時(shí)添加至底層瓊脂培養(yǎng)基（生長培養(yǎng)基,，1×，用于細(xì)胞稀釋）內(nèi),。

7. 在培養(yǎng)皿中加人 1 ml 0.6 % 的瓊脂培養(yǎng)基,，晃勻，確保培養(yǎng)基覆蓋整個(gè)培養(yǎng)皿底,。置于室溫定型,。

8. 制備細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù),。

9. 準(zhǔn)備 0.3% 瓊脂培養(yǎng)基,，保持 37°C ,。此培養(yǎng)基可以用 37°C 的 2× 培養(yǎng)基、55°C 的 1.2 % 瓊脂和 55°C 的 UPW 以 2:1:1 的比例混合制備,。

10. 制備以下稀釋濃度的細(xì)胞,，使細(xì)胞的最大濃度為 1×105 /ml。

(a)1×105 /ml

(b)將 1×105 /ml 稀釋 3 倍成 3.3×104 /ml

(c)將 3.3×104 /ml 稀釋 3 倍成 1.1×104 /ml

(d)將 1.1×104 /ml 稀釋 3 倍成 3.7×103 /ml

11. 將四種稀釋液的濃度分別標(biāo)在 4 個(gè)小玻璃瓶或試管上,，從每種稀釋液中吸出 40 μl,，包括 1×105 /ml 細(xì)胞液，分別放入相應(yīng)容器內(nèi) 37°C 加 4 ml 0.3% 瓊脂培養(yǎng)基,，混勻，再從每個(gè)容器（通用容器,，小玻璃瓶或離心管,，稀釋細(xì)胞用）中吸出 3 個(gè) 1 ml 分別加在相應(yīng)的三個(gè)培養(yǎng)皿上。最終濃度如下：

(a)1×103 /ml/皿

(b)330 /ml/皿

(c)110 /ml/皿

(d)37 /ml/皿

加細(xì)胞之前,，確保上層瓊脂培養(yǎng)基有足夠的時(shí)間冷卻至 37°C ,。

12. 待培養(yǎng)皿中的溶液在室溫下形成凝膠狀態(tài)。

13. 將培養(yǎng)皿放置在一個(gè)帶蓋的清潔塑料盒中,，37°C 加濕溫箱中培養(yǎng) 10 天,。

注意事項(xiàng)

準(zhǔn)備培養(yǎng)基和細(xì)胞之前，先算出細(xì)胞稀釋度,，在培養(yǎng)皿上做好標(biāo)記,，檢測(cè)一個(gè)細(xì)胞系的克隆形成率時(shí)，為每種稀釋度的細(xì)胞分別準(zhǔn)備3 個(gè)培養(yǎng)皿,。每個(gè)3. 5 cm 培養(yǎng)皿適宜接種的細(xì)胞數(shù)是1000,、333、111和 37 個(gè),。也就是依次 3 倍的稀釋細(xì)胞懸液,。如果需要加入生長因子、激素或其他添加劑,，應(yīng)加在下層的 0.6 % 瓊脂中,。

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