材料與儀器

肝素或枸櫞酸抗凝的血液樣本 D-PBSA Ficoll-Hypaque
無(wú)血清培養(yǎng)液
帶有鈍頭插管的注射器 塑料Pasteur吸管或移液器 血細(xì)胞計(jì)數(shù)器或電子細(xì)胞計(jì)數(shù)器 離心機(jī)

步驟

1. 用枸櫞酸或肝素抗凝容器采集血液標(biāo)本（肝素或枸櫞酸抗凝的血液樣本,，枸櫞酸或肝素的濃度依收集容器而定,。透明的離心管或普通容器）,，然后送到實(shí)驗(yàn)室。

2. 用 D-PBSA 按 1：1 稀釋后,，將 9 ml 血液加在 6 ml Ficoll-Hypaque （將比重調(diào)整為 1.077 g/cc）上,。使用帶蓋的粗大透明離心管如 25 ml Sterilin 或 Nimc 普通容器，或在 50 ml 透明的塑料 Corning 離心管中加入雙倍的液量,。

3. 離心（400 g,，15 min），這是在界面中心測(cè)量的離心速率,。

4. 不要攪動(dòng)界面,，小心地吸出血漿和 D-PBSA 層。

5. 帶有鈍頭插管的注射器或塑料巴斯德吸管收集含有淋巴細(xì)胞的液層,，然后用無(wú)血清培養(yǎng)液如 RPMI 1640 將其稀釋至 20 ml,。

6. 將稀釋的細(xì)胞懸液離心（70 g,，10 min）。

7. 棄去上淸液,，用 2 ml 無(wú)血清培養(yǎng)液混懸沉降細(xì)胞,。如果需要洗幾次（如除去血清因子），可再用 20 ml 無(wú)血清培養(yǎng)液混懸細(xì)胞,，離心 2 次或 3 次,。最后，用 2 ml 無(wú)血清培養(yǎng)液混懸沉淀細(xì)胞,。

8. 取一份細(xì)胞樣本,，用美藍(lán)染色，然后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)有核細(xì)胞,。取另一份細(xì)胞樣本,，用 Zapoglobin (Beckman Coulter) 溶解，利用 70~100 μm 口徑的管在電子細(xì)胞計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)細(xì)胞核,。

淋巴細(xì)胞與一些血小板和單核細(xì)胞集中于一層,。雖然在步驟 3 離心的大部分粒細(xì)胞主要見(jiàn)于 Ficoll-Hypaque 中，但有些粒細(xì)胞可位于淋巴細(xì)胞層,。通過(guò)利用單核細(xì)胞和粒細(xì)胞附著玻璃（微珠或培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)表面）或尼龍網(wǎng)的特點(diǎn),，能將單核細(xì)胞和殘留的粒細(xì)胞從淋巴細(xì)胞層中除去。如果需要分離更純的細(xì)胞,，可利用特異性淋巴細(xì)胞亞群的表面標(biāo)志物,，用 MACS 或 FACS 進(jìn)行陽(yáng)性分選。

注意事項(xiàng)

1. 人的血液可能受到 HIV ,、肝炎病毒或其他病原體等的感染,，在操作時(shí)應(yīng)當(dāng)特別小心。

   2. 不要用玻璃 Pasteur 吸管和帶有銳利針頭的注射器加注入的血液,，但可用 1 ml 移液器或帶有鈍頭插管的注射器,。

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