步驟

一,、原代培養(yǎng)

1. 取手術(shù)切除或早期活檢組織,，將組織放入轉(zhuǎn)運培養(yǎng)液（Leibowitz L-15培養(yǎng)液，添加 100 μg/ml 慶大霉素,、100 U/ml 青霉素,、100 μg/ml 鏈霉素和 1μg/ml     2性霉素B），盡快送到實驗室,。

2. 將組織移入 100 mm 培養(yǎng)皿,，用 P-PBSA （不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 Dulbecco PBSA）浸洗。

3. 盡量切除結(jié)締組織和有血液部分,。如果組織標(biāo)本的表面面積 ≥1 cm2,，將其切成小塊。

4. 將組織塊放入 35 mm 培養(yǎng)皿,，然后加入足夠 0.17 % 胰蛋白酶液（用 P-PBSA 配制）,，覆蓋組織塊。在 4°C 條件下孵育過夜,。

5. 用一把鑷固定組織塊,，用另一把鑷將上皮剝離入胰蛋白酶液。

6. 將組織懸液輕輕研磨幾次,，使細胞進一步分散,。然后，將細胞懸液移入離心管。

7. 用 D-PBSA 浸洗培養(yǎng)皿,，然后將浸洗液加入細胞懸液,。浸洗用量同步驟 4 組織消化的胰蛋白酶液。

8. 用微吸管吸取一等份測定細胞產(chǎn)量,。

9. 在4°C 條件下離心（125 g）,，最好用制冷離心機。用生長培養(yǎng)液混懸細胞,。

10. 按要求用含抗菌索的生長培養(yǎng)液（生長培養(yǎng)液添加 100 μg/ml 慶大霉素,、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 鏈霉素和 1 μg/ml   2性霉素B）稀釋細胞懸液,，然后將細胞接種于涂有 FN/C/BSA 的 50 mm 培養(yǎng)皿,，密度為 5×103 個/cm2。

11. 24 h 后換培養(yǎng)液,，以除去細胞碎片和紅細胞,。

12. 隔天換液。

二,、傳代培養(yǎng)

13. 用 D-PBSA 浸洗細胞,。

14. 加入 PET 液（含有 1 % 聚乙烯吡咯酮（PVP，40 KDa）,、0.5 mmol/L EGTA 和 0.025 % 胰蛋白酶,，用 D-PBSA 配制），完-全覆蓋細胞,，如在 100 mm 培養(yǎng)皿加入3 ml,。

15. 在室溫下孵育，直至細胞變圓或從培養(yǎng)皿去附著,。在顯微鏡下觀察細胞去附著情況,，此過程一般需要 1.5 min?？赏ㄟ^加入高濃度胰蛋白酶或在 37°C 條件下消化提高去附著效率,。

16. 當(dāng)大多數(shù)細胞去附著時，輕彈培養(yǎng)皿和用胰蛋白酶液吹打細胞,，以機械性地加強去附著,。

17. 細胞去附著后，向培養(yǎng)皿加入 5~10 ml D-PBSA,，終止胰蛋白酶的消化,。

18. 將細胞懸液注入離心管，輕輕研磨,，以使細胞充分混懸,。

19. 用 1 ml 吸管取細胞懸液,，加入血細胞計數(shù)板,，計數(shù)細胞,。

20. 計算懸液中細胞密度。

21. 在 4°C 條件下離心（125 g,，5 min）,。

22. 吸去上清液，用手指輕彈離心管,，直至沉下的細胞分散,。

23. 加入適量生長培養(yǎng)液，用吸管輕輕混懸細胞,，然后將細胞懸液注入培養(yǎng)皿,。

24. 將全部培養(yǎng)皿放入淺盤內(nèi)，用手移動淺盤,，并變化移動方向,，從而搖動培養(yǎng)皿。注意保證每個培養(yǎng)皿中的細胞密度均勻,，即搖動培養(yǎng)皿時集中于培養(yǎng)皿中心,。另外，應(yīng)注意將放培養(yǎng)皿的架平坦固定于孵育箱,，孵育箱不能振動,，以免細胞在貼壁過程中分布不均勻。

25. 將細胞靜置孵育 4~24 h,，然后換培養(yǎng)液,。