步驟

材料

無菌

培養(yǎng)瓶（如果需要離心時）

生長培養(yǎng)基

吸量管,，1ml，10ml

注射器和19號針頭（如果你使用玻璃凍存管）

非滅菌

保護性手套和面罩

37℃無菌水,，10cm深,，盛于清潔、用乙醇擦拭過的帶蓋的水桶中

鑷子

70%乙醇

棉簽

1%萘黑（酰胺黑）或0.4%臺盼藍

操作步驟

1.檢查凍存目錄，確定將要復蘇的凍存管的位置

2.收集所有材料,，準備培養(yǎng)基,，標記培養(yǎng)瓶

3.從凍存罐中取出凍存管，檢查標簽,，確定是否是所需要的凍存管,，若小管未浸沒在液氮中，將小管放入塑料除菌水桶內(nèi)37℃的燒杯中,。盡可能避免水沒過官帽,，因為會增加污染的機會。

安全提示

將凍存管從液氮中取出時,，必須穿實驗衣,，戴手套。若凍存管浸沒在液氮中,，則必須待面罩或護目鏡,，也必須穿實驗衣戴手套。儲存在液氮中的凍存管,，包括塑料小管都可能吸入液氮,，復蘇時將可能發(fā)生劇烈爆炸。該種情況下,，必須使用帶蓋的塑料水桶進行復蘇,，以控制-爆-炸。

4.當凍存管復蘇時,，再次檢查標簽以確定為所需的細胞,；隨后用70%乙醇徹-底擦洗凍存管，然后在超凈工作臺內(nèi)打開凍存管,，

5.用1ml吸管將凍存管內(nèi)含物轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中。

6.將培養(yǎng)基緩慢的加至細胞懸液中:以每2min 10ml的速率進行滴加,。開始時逐滴加入,，然后可加快，逐漸稀釋細胞和細胞保護劑,。

對于需要通過離心去除細胞保護劑的細胞：

（a）按照步驟6,，在離心管或常規(guī)容器內(nèi)緩慢稀釋細胞。

（b）100g離心2min,。

（c）棄去含有細胞保護劑的上清培養(yǎng)液,。

（d）以新鮮培養(yǎng)基重新懸浮細胞。

（e）接種入培養(yǎng)瓶,。

7.凍存管內(nèi)殘留物可用萘黑或臺盼藍染色,，以測定細胞的存活率。

8.24h后檢查：

（a）對于貼壁單層細胞，依據(jù)預測密度（個細胞/cm2)的細胞照片,，確認細胞是否貼壁,，估計細胞存活率。

（b）對于懸浮生長的細胞,，檢查外觀（清晰的細胞質(zhì),，缺乏細胞顆粒），稀釋至常規(guī)的接種濃度,。若進行細胞技術,，并估計細胞存活率后，接種濃度可能更精確,，這種情況下,， 可以將細胞稀釋至常規(guī)存活細胞接種濃度。

注意事項

1. 將凍存管從液氮中取出時,，必須穿實驗衣,，戴手套。若凍存管浸沒在液氮中,，則必須待面罩或護目鏡,，也必須穿實驗衣戴手套。儲存在液氮中的凍存管,，包括塑料小管都可能吸入液氮,，復蘇時將可能發(fā)生劇烈爆炸。該種情況下,，必須使用帶蓋的塑料水桶進行復蘇,，以控制-爆-炸。

2. 塑料凍存管在使用前要仔細檢查,，以防管壁破裂或螺口不配套造成密封 不嚴,。

3. 用DMSO作為凍存保護劑時，用前應先將凍存液在4℃預冷,，解凍后應馬 上洗去保護劑,。

常見問題

1. 檢查細胞活率。用1ml培養(yǎng)液重懸細胞,，臺盼藍染料排除法檢查細胞存活率,。

2. DMSO有-劇-毒，使用時要特別注意,。此外,，在凍存前越晚加入細胞越好，解凍后要盡快除去,，以避免對細胞的毒害,。