蛋白的含量的測定方法主要有紫外分光光度法,、Lowry法、BCA法等,。

紫外分光光度法

原理

蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)在275~280mm有一紫外吸收峰,。在一定濃度范圍內(nèi)，其在280mm的吸光度與蛋白濃度成正比,。

方法

取適量蛋白溶液（約3.5ml）,，置于光徑為1cm的石英比色杯、用與溶解蛋白的緩沖液相同的緩沖液為對照,，在280mm波長處測定吸光度,，吸光度為1.0的蛋白溶液，蛋白濃度約為1.0mg/ml,。當溶液中含少量核酸時,，應(yīng)同時測定260nm波長處的吸光度，以下式估算蛋白濃度：蛋白濃度（mg/ml）=1.55A280-0.75A260,。該測定方法誤差較大，有紫外光吸收的物質(zhì)（如核酸）干擾大,。

材料和儀器

（1）4%Na?CO3,；（2）0.2mol/LNaOH；（3）1%CuSO4,；（4）2%酒石酸鈉,。試劑A：使用前，將(1)(2)(3)(4)試劑以50：50：1：1的比例混合均勻,，當天使用,。試劑B：酚試劑。

Lorry法

Lowry法靈敏度較高,，線性范圍為20~100ug/ml,。該方法干擾因素主要有：高濃度的胍鹽、尿素等變性劑,，Triton,、Tween等去垢劑，EIDTA等整合劑,，以及Tris,、甘氨酸等等。

材料和儀器

材料：（1）4%Na?CO3；（2）0.2mol/LNaOH,；（3）1%CuSO4,；（4）2%酒石酸鈉。試劑A：使用前,，將(1)(2)(3)(4)試劑以50：50：1：1的比例混合均勻,，當天使用。試劑B：酚試劑,。

儀器：分光光度計,。

操作步驟

（1）準確稱取10mg標準蛋白（常用牛血清白蛋白或人血清白蛋白）加蒸餾水溶解定容至100ml。

（2）取6支試管分別編為0~5號,，分別加入步驟（1）制備的標準蛋白溶液0,、0.08、0.16,、0.24,、0.32、0.40ml,，并都用蒸餾水補足至0.4ml,。

（3）各試管加入試劑A 2ml，混勻,，室溫放置10分鐘,。

（4）各試管加入試劑B 0.2ml，立即混勻,，室溫或37℃水浴中,，保溫30分鐘。

（5）在分光光度計上,，以0號為參比,，測定各管樣品在750mm的吸光度值。

（6）以蛋白濃度為橫座標,，吸光度為縱座標繪制標準曲線,，或作直線回歸。

（7）取樣品溶液0.4ml,，按步驟（1）~（5）測定,，將測得的吸光度值代入上述標準曲線，計算蛋白濃度,。

注意：如果樣品濃度過高,，可用蒸餾水作適當稀釋。

BCA法

BCA法的優(yōu)點是抗干擾能力強,，其原理是：在堿性溶液中,，蛋白將二價銅還原成一價銅,，后者與試劑中的BCA（二辛可酸，Bicinchoninic acid）形成一個在562mm處具有最大吸光度的紫色復(fù)合物,，其吸光度與蛋白濃度成正比,，線性范圍20~100ug/ml。

材料和儀器

試劑A：1%BCA二鈉鹽,，2%碳酸鈉,，0.16%酒石酸鈉，0.4%氫氧化鈉和0.95%碳酸氫鈉,。用50%NaOH或碳酸氫鈉調(diào)pH11.25,。

試劑B：4%硫酸銅

工作液：100倍體積試劑A與2倍體積試劑B混合。

操作步驟

（1）準確稱取10mg標準蛋白（常用牛血清白蛋白或人血清白蛋白）加蒸餾水溶解定容至100ml,。

（2）取6支試管分別編為0~5號,，分別加入步驟1制備的標準蛋白溶液0、20,、40,、60、80,、100 ul,，并都用蒸餾水補足至100ul。

（3）各試管加入工作液2ml,，混勻,，37℃水浴保溫30分鐘。

（4）在分光光度計上,，以0號為參比,，測定各管樣品在562mm的吸光度值。

（5）以蛋白濃度為橫座標,，吸光度為縱座標繪制標準曲線，或作直線回歸：

（6）取樣品溶液100 ul,，按步驟1~4測定,，將測得的吸光度值代入上述標準曲線，計算蛋白濃度,。

注意：如果樣品濃度過高,，可用蒸餾水作適當稀釋。

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