流式細胞周期檢測是一種常見的檢測細胞增殖情況的方法之一,，細胞在不同周期時，其內(nèi)的DNA含量不同,。碘化丙啶（PI）作為一種核酸嵌入型染料,，能夠進入固定后的細胞中，與細胞內(nèi)的核酸結(jié)合,，其熒光強度與DNA含量成正比,。通過流式細胞儀檢測不同細胞中的熒光強度，從而判定不同組別中細胞周期發(fā)生的變化,。

用途

檢測不同組別或處理對某種細胞周期的改變,。

材料與儀器

【器材】
流式細胞儀、移液器,、槍頭,、離心管、離心機,、流式細胞儀,、水浴鍋、流式管,、濾頭,；
【試劑】0.25％胰蛋白酶溶液、PBS,、RNA酶,、PI染液、70％乙醇溶液（建議提前放入負二十預冷）,；

步驟

1.以腫瘤細胞為例,，將正常生長的對照或處理組腫瘤細胞計數(shù)，每組取2×105-3×105個細胞鋪板,，待細胞貼壁后,，將正常培養(yǎng)基替換為無血清1640培養(yǎng)基，同步化20 h,，使得所有細胞都進入相同的細胞周期時期,；同步完后，將培養(yǎng)基重新替換為正常含血清培養(yǎng)基,，繼續(xù)培養(yǎng)24 h,；

2.用不含EDTA的胰酶將細胞消化，收集細胞，300 g,，離心3 min,；用吸引器去除培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞一次,，再次300 g,，離心3 min；去除PBS,，用提前預冷的70%酒精重懸細胞沉淀,，4℃固定過夜；

3．4℃,，1000 g,，離心3-5 min,，去除酒精,，用PBS清洗3遍，最后一遍去除PBS,；加入300 μL PBS,，輕輕吹打，重懸細胞沉淀,，加入相應量的Rnase至終濃度100 μg/mL,，37 ℃水浴鍋中消化30 min；

4．上機前加入PI（5 mg/mL）至終濃度50 μg/mL,，避光孵育15 min,；孵育完后，過300目細胞篩,，上機檢測,；

5.分析數(shù)據(jù)。

注意事項

1. PI為致癌物質(zhì),，避免用手直接接觸,。

2. 細胞數(shù)目應該達到2x104個，細胞數(shù)目過少影響實驗結(jié)果的準確性,。

3.鋪板的細胞數(shù)量以收獲細胞時有足夠的生長空間來動態(tài)調(diào)節(jié),，現(xiàn)在的流式細胞儀靈敏度很高，不需要太多的細胞,。

4. 在制備時,，要清洗干凈酒精，特別注意清洗過程中細胞的損失,。離心次數(shù)不宜過多,，防止細胞丟失。

5. 可以用未處理的細胞調(diào)試流式細胞儀,。

6.胰酶不加EDTA

常見問題

Q:酒精固定后細胞難以沉淀下來,，導致細胞丟失較多,；

A:可適當延長離心時間和轉(zhuǎn)速。

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細胞周期檢測（流式細胞術(shù)）

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