1,、免疫組化實(shí)驗(yàn)所用的組織和細(xì)胞標(biāo)本有哪些,？

實(shí)驗(yàn)所用主要為組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片,，后者包括組織印片,、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標(biāo)本最為常用,、最基本的方法,，對于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察,；還能長期存檔,，供回顧性研究；石蠟切片制作過程對組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響,，但可進(jìn)行抗原修復(fù),，是免疫組化中最佳的組織標(biāo)本制作方法。

2,、石蠟切片為什么要做抗原修復(fù),？有哪些方法？

石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定,，使得細(xì)胞內(nèi)抗原形成醛鍵,、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇，同時(shí)蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽,。所以要求在進(jìn)行IHC染色時(shí),，需要*行抗原修復(fù)或暴露，即將固定時(shí)分子之間所形成的交聯(lián)破壞,，而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài),。常用的抗原修復(fù)方法有微波修復(fù)法，高壓加熱法,，酶消化法,，水煮加熱法等，常用的修復(fù)液是pH6.0的0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液,。

3,、免疫組化常用的染色方法有哪些？

根據(jù)標(biāo)記物的不同分為免疫熒光法,，免疫酶標(biāo)法,，親和組織化學(xué)法，后者是以一種物質(zhì)對某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)的檢測方法,。這種方法敏感性更高,，有利于微量抗原(抗體)在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最為常用,。

4,、石蠟切片在染色過程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象

1）烤片時(shí)間不夠,，或溫度不夠,，可以延長烤片時(shí)間和提高烤片溫度； 

2）用含有多聚賴氨酸的玻片,，可以購買到或這自己做,；

3）有些組織本身就容易掉片，如骨組織等，操作時(shí)沖PBS不要直接沖到組織上,，沖到組織上方,，讓它流下沖洗組織； 

4）用高溫修復(fù)時(shí),，溫度驟冷也可能引起,。 

5、邊緣效應(yīng)

1）組織邊緣與玻片粘貼不牢,，邊緣組織松脫漂浮在液體中,，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致. 解決辦法：制備優(yōu)質(zhì)的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片,，不厚于4微米,，組織的前期處理應(yīng)規(guī)范，盡量避免選用壞死較多的組織,；

2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織,，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深,。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織,，應(yīng)超出組織邊緣2mm。用組化筆畫圈時(shí),，為了避免油劑的影響,，畫圈應(yīng)距組織邊緣3-4mm。

6,、產(chǎn)生組織切片非特異性染色

1）抗體孵育時(shí)間過長,、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時(shí)間,、稀釋抗體來控制,。這是最重要的一條； 

2）一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色,，建議試用單克隆抗體看看,； 

3）內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織）,，需要通過延長滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來降低背景染色,； 

4）非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長二抗來源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果,； 

5）DAB孵育時(shí)間過長或濃度過高,； 

6）PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色,，在一抗,、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要； 

7）標(biāo)本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色,。

7,、免疫組化染色呈陰性結(jié)果

1）抗體濃度和質(zhì)量問題以及抗體來源選擇錯(cuò)誤；   

2）抗原修復(fù)不全,，對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來打開抗原表位,，以利于與抗體結(jié)合；建議微波修復(fù)用高火4次*6min試試,。有人做過實(shí)驗(yàn),，這是最佳的時(shí)間和次數(shù)。若不行,，還可高壓修復(fù),； 

3）組織切片本身這種抗原含量低；

4）血清封閉時(shí)間過長,；

5）DAB孵育時(shí)間過短,；

6）細(xì)胞通透不全，抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng),；

7）開始做免疫組化,，我建議你一定要首先做個(gè)陽性對照片，排除抗體等外的方法問題,。

8,、背景

1）考慮一抗?jié)舛雀撸?/p>

2）然后調(diào)整DAB孵育時(shí)間；

3）也要考慮血清封閉時(shí)間是否過短,；

4）適當(dāng)增加抗體孵育后的浸洗次數(shù)和延長浸洗時(shí)間等,。

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