變性條件——SDS LB直接裂解：

用常溫或者高溫預熱過（預熱更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化,，但容易遺忘，而LB久煮會改變某些性質）的1*SDS LB（或者略高1.5*）直接加到細胞或者組織上并煮樣,。

通常6孔板細胞80%以上密度,，需200ul，其他按平板面積比類推,。通常條件下,，SDS LB都是過量的（因此不一定要嚴格參考SDS LB稀釋比）；如果SDS LB不夠,，樣品核酸,、蛋白濃度過高時，煮樣后會發(fā)現(xiàn)tip吸不上來,，非常粘,、一砣一砣的，很容易堵住tip,。

這時候常規(guī)做法有兩種：

1.再煮5min,。常規(guī)煮樣時間3-5min，樣品過濃時就煮10min,；

2.如果10min煮樣后,，仍然吸不起來，才適當增加SDS LB,，繼續(xù)煮,；也可以對樣品進行超聲。煮樣時間若過長，蛋白會凝固,，此時以失去繼續(xù)WB的意義,，請丟棄（判斷標準：出現(xiàn)明顯的蛋白沉淀和水分層）

此方法的缺點是：SDS LB煮過的樣品如果用來做IP，需要特殊方法,，因此,，這種制備方法制備的樣品有使用局限。

非變性裂解法：

裂解細胞請盡量冰上操作,，減緩酶解作用,。

裂解液配方是：20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl,1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors (20μg/ml leupeptin,10μg/ml pepstatin A and 10 μg/mlaprotinin)（此裂解液可用于抽提核蛋白），其中蛋白酶抑制劑可用0.5mMPMSF替代,；如果還要做磷酸化蛋白,，加1mM Na3VO4（現(xiàn)加現(xiàn)用），10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 50 mMbeta-GP,。

此方法的優(yōu)點：NaCl濃度略低于生理狀態(tài),，保證裂解細胞的方式較為溫和，便于隨后的IP等試驗,。其他Na鹽濃度的細胞裂解液也很常見,，諸如0.15M（生理鹽濃度）,、0.3M,、0.6M（高鹽系列，裂解細胞時染色體會析出,，細胞碎片和沉淀非常粘稠）及0.8-1.2M,；0.3M及以下適合 IP試驗，0.6M及以上適合純化蛋白,，尤其相互作用較強的復合體,，要得到純化的一些復合體的組成蛋白一般采用（木及）端的高鹽裂解細胞。

組織塊裂解：

組織塊較大用勻漿的方法最合適,，現(xiàn)在有不少轉頭很小的勻漿器,。

當組織超微量的時候，比如50mg新鮮癌組織,，建議采用的方法是

1. 低溫（剪）攪碎,，成肉糜狀。

2. 錫箔紙包裹好,，放入少量液氮,，快速敲擊（控制力量，盡量避免弄破錫箔紙）,，進一步破碎,；反復多次。

3. 用上述細胞裂解液回收。

分泌型蛋白富集：

用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,，收集上清液用于WB檢測,；如果含量過低，需要用TCA沉淀富集,。

理論上,，從普通培養(yǎng)基中收集分泌蛋白，此時對細胞生長條件的影響最小,，是最佳的實驗條件,；但是這存在隱憂。因為含血清的培養(yǎng)基中含有非常豐富的BSA（牛血清白蛋白）之類的蛋白質,，除非你進一步分離純化,，否則直接用這種樣品去WB會有非常大的麻煩，尤其當你的蛋白在60-46kDa之間的時候,；用“任何"抗體去檢測這一區(qū)間的蛋白,，都會有一片非常強的信號。因為此區(qū)間蛋白（主要是BSA）濃度過于富集,，會非特異性粘附“任意"抗體,，從而最終被識別。同理,，采用SDS LB裂解細胞制備樣品前,，通常要用PBS洗滌，其目的之一是去除培養(yǎng)基中的BSA,。

采用無血清培養(yǎng)基收集細胞上清除了改變細胞的生理狀態(tài)外（可能激活未知信號途徑,，諸如AKT等），還會出現(xiàn)的問題是：

1. 即使采用了無血清收集上清,，仍然有大量雜蛋白,，但相對好很多。

2. 選用了上清,，由于蛋白濃度太稀,，通常要采用TCA沉淀富集，再重新溶解,。

a. TCA沉淀對半定量操作要求非常高,，因為很容易沉淀不充分或者離心操作丟失，尤其在離心過程,，離心管的擺放非常講究,，要180度翻轉離心兩次。

b,。重新溶解時,，由于蛋白需要在一定的鹽離子條件下才能重新溶解,，你要摸索充分溶解的條件，相對麻煩,。

實際上,，如果你不是非常強調蛋白的分泌有什么生理功能，一般不建議檢測上清,，尤其半定量的WB實驗檢測不同樣品間的差異,。