在細(xì)胞培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)這樣或那樣的問題，這些問題從細(xì)胞生長角度來說,，針對細(xì)胞不貼壁,、生長緩慢、生長不好,，甚至死亡的原因,，我們做以下分析并提出相對應(yīng)的解決方法。

一,、培養(yǎng)細(xì)胞不貼壁

可能原因： 

●胰蛋白酶消化過度 ,；

●支原體污染 ；

●培養(yǎng)基pH值過堿（NaHCO3分解）,；              

●細(xì)胞老化 ,；

●接種細(xì)胞起始濃度太低或太高 。

解決方法： 

●縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度,； 

●分離培養(yǎng)物,，檢測支原體。清潔支架或培養(yǎng)箱,。如發(fā)現(xiàn)支原體污染,，丟棄培養(yǎng)物；

●使用無菌醋酸溶液調(diào)整pH值或充入無菌CO2 ,；

●啟用新的保種細(xì)胞 ,；

●調(diào)節(jié)最佳接種細(xì)胞濃度。

二,、懸浮細(xì)胞成簇

可能原因： 

●培養(yǎng)液中含鈣,、鎂離子 ；

●支原體污染,；

●蛋白酶過度消化使得細(xì)胞裂解,；

●DNA污染 。

解決方法： 

●用無鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞，輕巧吹吸細(xì)胞獲得單細(xì)胞懸液,；

●分離培養(yǎng)物,，檢測支原體；

●用DNaseI處理細(xì)胞,。

三,、培養(yǎng)細(xì)胞生長緩慢

可能原因：

●由于更換不同培養(yǎng)液或血清； 

●培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞,； 

●培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染,； 

●試劑保存不當(dāng)； 

●接種細(xì)胞起始濃度太低,； 

●細(xì)胞已老化,； 

●支原體污染 。

解決方法： 

●比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分,，比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長實驗,，讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液； 

●換入新鮮配置培養(yǎng)液,，或補加谷氨酰胺及生長因子,；

●用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染,，丟棄培養(yǎng)物,；

●血清需保存在-10到-20℃。培養(yǎng)液需在2-8℃避光保存,。含血清*培養(yǎng)液在2-8℃保存,，需在1周內(nèi)用完；

●增加接種細(xì)胞起始濃度,； 

●換用新的保種細(xì)胞,； 

●分離培養(yǎng)物，檢測支原體,。清潔支架和培養(yǎng)箱,。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物,。

四,、培養(yǎng)細(xì)胞生長不好

可能原因：

●細(xì)胞本身的狀態(tài)

細(xì)胞傳代次數(shù)多，細(xì)胞老化,；

細(xì)胞的接種量：接種量過低,，細(xì)胞生長緩慢；

細(xì)胞傳代時間過晚：細(xì)胞中毒,，影響傳代后的細(xì)胞生長,；

胰酶消化時間過長或過短：時間過長,，細(xì)胞死亡；時間過短,，細(xì)胞未*分離而成團,，細(xì)胞死亡；

細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇：慢凍速融,。

●污染

支原體污染,；

霉菌污染。

●培養(yǎng)基或血清

更換血清或培養(yǎng)基之前未進行驗證,；

選擇的培養(yǎng)基是否合適,；

培養(yǎng)基配制是否準(zhǔn)確無誤。

●培養(yǎng)環(huán)境

CO2供應(yīng)是否正常,；

培養(yǎng)箱或搖床溫度控制是否正確。

解決方法：

根據(jù)以上四個方面的可能原因,，做出針對性的解決方案

●注意細(xì)胞的本身狀態(tài)：如傳代次數(shù),、接種量等；

●避免產(chǎn)生污染（用正規(guī),、合法,、可溯源的血清）；

●要用合適的血清或培養(yǎng)基,，最好經(jīng)過驗證,；

●注意實驗室的環(huán)境。

五,、培養(yǎng)細(xì)胞死亡

可能原因： 

●培養(yǎng)箱內(nèi)無CO2,； 

●培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動太大； 

●細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過程中損傷,； 

●培養(yǎng)液滲透壓不正確,； 

●培養(yǎng)液中有毒代謝產(chǎn)物堆積 。

解決方法： 

●檢測培養(yǎng)箱內(nèi)CO2,； 

●檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度,； 

●取新的保存細(xì)胞種； 

●檢測培養(yǎng)液滲透壓,； 

●換入新鮮培養(yǎng)液,。

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