細胞轉(zhuǎn)染是細胞生物學和分子生物學的一種常用的技術手段。而轉(zhuǎn)染效率低卻是實驗童鞋們經(jīng)常遇到的問題，尤其是原代細胞轉(zhuǎn)染,，更是因為難度大，號稱誰碰誰死，而令人談虎色變,。不，應該是談原代細胞色變,。那么,，當實驗進行到轉(zhuǎn)染這一步時有哪些坑要避免?需要注意的因素有哪些呢?

一、細胞系的選擇

細胞系選擇有時是實驗的需要，有時是實驗室條件的限制,。如果有選擇的余地當然挑個容易做的,。越是接近體內(nèi)的真實情況的原代細胞，通常越是難于伺候,。反之亦然,。此外細胞本身的特性也是需要考慮的因素。有時需要根據(jù)細胞系來選擇合適的轉(zhuǎn)染方法;而有時一些啟動子在不同的細胞系中表現(xiàn)的功能也不同,。這些都是設計實驗時需要考慮的因素,，姑且不論。不過因為受限于特定的細胞,，如何選擇合適的轉(zhuǎn)染方法就值得考究了,。因為不同的細胞可能適用不同的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染條件。如果實驗室已經(jīng)建立了全套方法,，照做可也,。如果是個新來的細胞株，最好查查資料看哪些成功轉(zhuǎn)染案例,。

二,、預實驗準備充足

我們做細胞轉(zhuǎn)染的時候，在開展正式實驗前要多做預試驗,，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,。優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件包括：轉(zhuǎn)染試劑的用量、DNA密度,、細胞密度,、轉(zhuǎn)染試劑和DNA混合孵育時間等等。

三,、電轉(zhuǎn)染電壓控制

做電轉(zhuǎn)的時候,，如果電壓太大，往往會發(fā)生細胞大量死亡的情況,。不同的細胞,，需要的電壓是不一樣的。這就要求我們多做預實驗,，多摸索條件,。對于大多數(shù)細胞來說，其最佳電壓位于250-1250v/cm,。另外,，就是進行轉(zhuǎn)染的細胞應該處于對數(shù)生長期。處于對數(shù)生長期的細胞的抗損傷能力是很強的,。細胞濃度應該處于5x106到1x107/mL之間,。每次轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒應該控制在4-6 μg,，如果﹥10μg，轉(zhuǎn)染效率也大大降低,。電擊后,，應該將DNA和細胞混合液在室溫下放置10分鐘，使細胞恢復損傷,。

四,、試劑品質(zhì)的選擇

有時候轉(zhuǎn)染效率低下，還要考慮會不會存在試劑過期的情況,。根據(jù)經(jīng)驗,，盡量避免使用到過期的轉(zhuǎn)染試劑，因為過期后,，就算沒有過失效期,，但是細胞毒性大大增加，而轉(zhuǎn)染效率卻大大下降,。千萬不要為了省錢，影響實驗進度哈,。這轉(zhuǎn)染試劑這方面的選擇,，目前已出到第三代多肽小分子材料的新型轉(zhuǎn)染試劑，推薦ZETA LIFE品牌的DNA,、RNA高效轉(zhuǎn)染試劑（貨號：AD600150）,，轉(zhuǎn)染效率大大提高不少。

五,、血清培養(yǎng)很重要

轉(zhuǎn)染后未及時加入血清,，會導致細胞大量死亡。一般要在轉(zhuǎn)染后的4-6小時換液且換為有血清的培養(yǎng)基,。根據(jù)轉(zhuǎn)染實驗的經(jīng)驗,，其實也可以在原來的無血清培養(yǎng)基里面滴加血清。這個時候,，最好不要換液,，不要打擾細胞，讓它安安靜靜地休息,。但是也不能過早加入血清,。過早的話，會引起未轉(zhuǎn)染的細胞不受控制生長,。那么,，什么是最佳時機呢?在20%的細胞變圓的時候，就是加血清的最佳時機,。不過要特別注意：對于RNA轉(zhuǎn)染,，如何消除血清中潛在的RNase污染是值得關注的。所以血清的質(zhì)量也是需要關注的。新加培養(yǎng)基的預熱對細胞轉(zhuǎn)染很有幫助,。

六,、防止細胞污染

細胞污染也是造成細胞死亡，轉(zhuǎn)染效率低下的一大原因,。首先,，轉(zhuǎn)染細胞用的質(zhì)粒必須保證無菌。而現(xiàn)在市場上的一般的質(zhì)粒提取試劑盒都做不到絕對無菌,。業(yè)內(nèi)有個一個獨門絕招：將提完質(zhì)粒后或者提的最后一步,，用75%乙醇沉淀，這樣就除菌了,。

七,、質(zhì)粒數(shù)量保證

轉(zhuǎn)染用的質(zhì)粒首先要保證數(shù)量，一般為2 μg以上,。質(zhì)粒純度不夠或者含有細菌LPS或其他對細胞有毒害作用的物質(zhì),，也會影響轉(zhuǎn)染效率。這個時候,，就應該對質(zhì)粒進行純化和濃縮,。

八、注意細節(jié)

在轉(zhuǎn)染之前更換一次37℃預溫的培養(yǎng)基,，可提高轉(zhuǎn)染效率,。轉(zhuǎn)染試劑和DNA/RNA混合物應當一滴一滴地滴下來，從培養(yǎng)皿一邊滴到另一邊,，邊滴邊輕搖培養(yǎng)皿,，以確保均勻分布和避免局部高濃度。這些都是一些細枝末節(jié),，但是如果不注意的話,，也會造成轉(zhuǎn)染效率低下。

九,、細胞狀態(tài)良好

十,、注意鋪板的密度

十一,、合適的培養(yǎng)基

健康的細胞培養(yǎng)是一切成功轉(zhuǎn)染的基礎,。不同的細胞類型有不同的特性，需要特定的培養(yǎng)基,、血清,、補充添加劑等等。

十二,、抗生素的控制

支原體,、細菌,、真菌污染，無論對于細胞培養(yǎng)或者轉(zhuǎn)染都是“不堪回首的痛”,，可能會嚴重影響轉(zhuǎn)染結果,，細胞培養(yǎng)過程中往往會添加抗生素來防止污染。但是這些添加劑可能對轉(zhuǎn)染造成麻煩,。比如青霉素和鏈霉素,，就是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對于真核細胞無毒,，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細胞的通透性,，使抗生素可以進入細胞。這可能間接導致細胞死亡,，造成轉(zhuǎn)染效率低,。所以整個過程都不要用抗生素。

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