步驟

1. 一周齡Wistar大鼠,，斷頸處死,，于75%乙醇浸泡15 分鐘，無菌取出胰腺,，于冰冷無菌D-Hanks’液中漂洗,，用眼科剪仔細清除脂肪,、包膜、血管等胰外組織,，轉(zhuǎn)入青霉素小瓶中,。

2. 加入少量無菌D-Hanks’液，用眼科剪剪成0.1-1.0 mm3 大小的碎片,，用滴管輕輕吸出上層細小脂肪碎塊和油滴,，再用無菌D-Hanks’液反復(fù)清洗 8——10 次，加入10 倍體積無菌消化酶液[胰蛋白酶-膠原酶消化液： 0.05 g 胰蛋白酶,，0.025 g Ⅴ型膠原酶（663 U/mg）,，0.05g葡萄糖，溶于100ml無 Ca2+,、Mg2+的0.01 mol/L PBS（pH 值為 7.4）溶液,，用0.22 µm 微孔濾膜濾菌]，38℃±1℃消化,，消化過程中不斷震蕩,，10 分鐘后棄去上清液。

3. 用無菌D-Hanks’液將組織塊清洗 2——3 次,，加入新鮮酶液繼續(xù)消化,，重復(fù)上述步驟，此時組織塊邊緣模糊,。

4. 將組織塊浸入消化酶液中,，38℃±1℃消化10 分鐘，將消化酶液與組織塊分開,，組織塊重新加入新鮮消化酶液進行消化,；而原消化酶液1500 rpm離心 10 分鐘，取沉淀即為消化下的細胞,，重新用無菌D-Hanks’懸浮,，離心，重復(fù) 1——2 次,，再用培養(yǎng)基洗 2——3 次,，用培養(yǎng)基懸浮即得細胞懸液。

5. 將消化過的組織塊重復(fù)消化5——6 次至組織塊消化*,，重復(fù)以上操作,。

6. 合并幾次所得細胞懸液，計數(shù),，調(diào)整細胞濃度為 2×105個細胞/mL,，將細胞懸液接種于24 孔塑料培養(yǎng)板中，每孔1 ml,，置于37℃,，5%CO2,，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

7. 由于成纖維細胞貼壁要比胰島細胞迅速,，接種15 h 后,，輕輕振蕩培養(yǎng)板，將上面未貼壁的細胞接入新的培養(yǎng)板中,，可除去部分成纖維細胞,。

8. 將新培養(yǎng)板中細胞培養(yǎng) 48 小時后，換新鮮配置的含有2.5 ng/mL 的碘乙酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)5 h,，可除去絕大部分成纖維細胞,，而胰島細胞不受傷害，換不含碘乙酸的培養(yǎng)基洗2次,，并換不含碘乙酸的培養(yǎng)基在 37℃,、5% CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),，每隔 3 天換培養(yǎng)液,，獲得單層胰島細胞。