細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子如 DNA RNA 等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。可分為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染等

    瞬時(shí)轉(zhuǎn)染是指外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色體中,，因此一個宿主細(xì)胞可存在多個拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá),，但通常只持續(xù)幾天,，多用于啟動子和其他調(diào)控元件的分析,。一般來說，超螺旋質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)染效率較高,，在轉(zhuǎn)染后 24-72 h 內(nèi)分析結(jié)果,，常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來幫助檢測,。

    穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是指外源 DNA 既可以整合到宿主染色體中,，也可能作為一種游離體存在。盡管線性 DNA 比超螺旋 DNA 轉(zhuǎn)入量低但整合率高,。外源 DNA 整合到染色體中概率很小,，通常需要一些選擇性標(biāo)記反復(fù)篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。

主要有下面幾種方法：

化學(xué)法：磷酸鈣法,、DEAE-右旋糖苷法,、陽離子脂質(zhì)體法；物理法：電穿孔法,、顯微注射法,、biolistic 顆粒傳遞法；病毒介導(dǎo)法：逆轉(zhuǎn)錄病毒,、腺病毒

A. 陽離子脂質(zhì)體法：

    帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞,。過程如下圖：

   特點(diǎn)：

    簡單通用，適用性廣,，轉(zhuǎn)染效率高,，重復(fù)性好，但轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清,，轉(zhuǎn)染效率隨細(xì)胞類型變化大,。由于脂質(zhì)體復(fù)合物與貼壁細(xì)胞的接觸機(jī)會遠(yuǎn)大于懸浮細(xì)胞，所以貼壁比懸浮轉(zhuǎn)染效率要高,。懸浮細(xì)胞建議使用電穿孔法,。

B. 電穿孔法：

    利用高壓電脈沖對細(xì)胞膜的干擾，使其形成利于核酸進(jìn)入的微孔,。

C. 逆轉(zhuǎn)錄病毒（RNA）：

    通過病毒中膜糖蛋白和宿主細(xì)胞表面的受體相互作用進(jìn)入宿主細(xì)胞,，之后反轉(zhuǎn)錄酶啟動合成 DNA 并隨機(jī)整合到宿主基因組中。

    特點(diǎn)：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,，可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,、原代細(xì)胞，體內(nèi)細(xì)胞等,，但攜帶基因不能太大,。

D. 腺病毒（雙鏈 DNA）：

    先和細(xì)胞表面的受體結(jié)合，繼而在αV 整合素介導(dǎo)下被細(xì)胞內(nèi)吞,。

    特點(diǎn)：可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,。

    影響轉(zhuǎn)染的因素：

    血清 血清影響復(fù)合物的形成,，降低轉(zhuǎn)染效率

    陽離子脂質(zhì)體和 DNA 的最佳量在使用血清時(shí)會有所不同，因此想在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清時(shí)要進(jìn)行條件優(yōu)化,。大部分細(xì)胞可以在無血清培養(yǎng)基中幾個小時(shí)內(nèi)保持健康,，對于對血清缺乏比較敏感的細(xì)胞，可以使用 OPTI-MEM I 培養(yǎng)基,。對于對血清缺乏比較敏感的貼壁細(xì)胞，建議使用 LIPOFECTAMINE 2000,。

    抗生素

    比如青霉素和鏈霉素,，是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對于真核細(xì)胞無毒,，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性,，使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性,，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低,。

    細(xì)胞代數(shù)

    轉(zhuǎn)染前細(xì)胞最好經(jīng)過 1-2 次傳代保證細(xì)胞生長旺盛容易轉(zhuǎn)染，注意貼壁細(xì)胞一旦長滿就不好轉(zhuǎn)染,。

    細(xì)胞鋪板密度

    一般轉(zhuǎn)染時(shí),，貼壁細(xì)胞密度為 70%-90%，懸浮細(xì)胞密度為 2*10^6--4*10^6 細(xì)胞/ml 時(shí)效果較好,。確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞沒有長滿或處于靜止期,。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量。

    DNA 質(zhì)量

    DNA 質(zhì)量對轉(zhuǎn)染效率影響非常大,。一般的轉(zhuǎn)染技術(shù)基于電荷吸引原理,，如果 DNA 不純，如帶少量的鹽離子,，蛋白,，代謝物污染都會顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成和轉(zhuǎn)染的進(jìn)行。

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