1. 單個大腸桿菌克隆接種到 2 ml 含適當抗生素的 LB 中,。37℃ 劇烈振蕩孵育 5~8 小時,。或者可以培養(yǎng)過夜使飽和,。

2. 倒 1.5 ml 培養(yǎng)液到已作標記的微量離心管中,。把剩下的培養(yǎng)液存放在 4℃,。

3. 在微量離心機上離心 2 分鐘以沉淀大腸桿菌。吸掉培養(yǎng)液,。

4. 用 100 ul 葡萄糖緩沖液重懸沉淀物,。在室溫孵育 5 分鐘。在這時候充分懸浮大腸桿菌對于獲得盡可能大的產(chǎn)量是很重要的,。

葡萄糖緩沖液（配 500 ml）

50 mmol/L 葡萄糖    4.5 g 葡萄糖

10 mmol/L EDTA,，pH 8.0       10 ml 0.5 mol/L EDTA，pH 8.0

25 mmol/L Tris-HCl,，pH 8.0   12.5 ml 1.0 mol/L Tris-HCl,，pH 8.0

過濾除菌，貯存在 4℃,。

5. 在管中加 200 ul NaOH-SDS 溶液,，輕輕地顛倒混合。冰浴 5 分鐘,。溶液應該明顯變清了,，但仍然非常黏。

NaOH-SDS 溶液（配 50 ml）

0.2 mol/L NaOH   0.4 g NaOH

1% SDS    2.5 ml 20% (w/v) SDS

可在室溫存放 2~3 周,。

6. 每個管中加 150 ul 冷的 3 mol/L 乙酸鉀,，pH 5.2，顛倒混合,；冰浴 5 分鐘,，會形成白色絮狀沉淀。

3 mol/L 乙酸鉀：

5 moI/L 乙酸鉀 60 ml

冰乙酸 11.5 ml

加水到 100 ml,。貯存在 4℃,。

7. 在小離心機上離心 5 分鐘，然后轉(zhuǎn)移 400 ul 上清到一個已作標記的管中,。

8. 管中加 0.5 ml 酸/氯仿/異戊醇（50:49:1) 溶液,，振搖，在離心機上離心 5 分鐘,。

酚/氯仿/異戊醇（50:49:1)

50% TE 飽和酚

49% 氯仿

1% 異戊醇

避光貯存于 4℃,。

9. 小心地把水相（上層）轉(zhuǎn)移到已作標記的管中,。

10. 加 1.0 ml 100% 乙醇，混合,，然后離心 5 分鐘沉淀 DNA,。

11. 去掉上清。應該能看到一個小的白色沉淀物,。加 1.0 mI 70% 乙醇洗滌沉淀物,，并離心 5 分鐘。

12. 去掉上清,。管子離心 5 秒鐘使殘余液體流到管底,。吸掉液體，讓乙醇揮發(fā) 5~10 分鐘,。（或者可以真空干燥管子,。）

13. 用 25~50 ul 的 TE（pH 8.0）重懸沉淀物。質(zhì)粒 DNA 應該很容易溶解,。不易溶解的物質(zhì)很可能不是 DNA,。

14. 在這 32 uI DNA 溶液中加 8.0 ul 4 mol/L NaCl 和 40 ul 113% (w/v) PEG8000?；旌暇鶆虿⒈?1 小時或更長時間,。

15. 用小離心機在 4℃ 離心 15 分鐘以沉淀 DNA。

16. 小心去掉上清并加 1.0 ml 70% 乙醇洗滌沉淀物,，離心 5 分鐘,。

17. 小心去掉乙醇，離心 5 秒鐘使殘余液體流到管底,。吸掉液體并讓乙醇揮發(fā) 5~10 分鐘,。

18. 根據(jù)測序方法的要求用 20~30 ul TE 或水重懸沉淀物。

純化質(zhì)粒（堿裂解法）

材料與儀器

步驟

會員登錄

收藏該商鋪

提示