轉(zhuǎn)染(transfection)是真核細(xì)胞主動或被動導(dǎo)入外源核酸片段（DNA或RNA）而獲得新的表型的過程,。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞會產(chǎn)生重組蛋白，或者特異性的增強/抑制細(xì)胞中的基因表達,。轉(zhuǎn)染后的檢測主要包括基因水平和蛋白水平的檢測,。一定時間后收集轉(zhuǎn)染處理后的細(xì)胞,，采用超聲或酶解的方法破碎細(xì)胞,，離心得到上清。針對基因水平,，使用普通 PCR 或 RT-PCR 進行驗證,，蛋白水平，使用 western blot 檢測,，簡單,，快速，準(zhǔn)確,。

轉(zhuǎn)染的類型

根據(jù)導(dǎo)入的核酸存在于宿主細(xì)胞的時間長短,，可以分為瞬轉(zhuǎn)和穩(wěn)轉(zhuǎn)。根據(jù)轉(zhuǎn)染方式可以分為化學(xué)方法,，生物方法,，物理方法。

瞬時轉(zhuǎn)染是指將構(gòu)建好的質(zhì)?；蛘遱iRNA通過某種方式導(dǎo)入到哺乳動物細(xì)胞內(nèi)（常用的工具細(xì)胞 HEK293 細(xì)胞）,，該外源核酸片段不整合到細(xì)胞自身的基因組上。隨著細(xì)胞的生長分裂,，外源基因會逐漸丟失,，在細(xì)胞內(nèi)能夠存在 3-4 天，無法隨著細(xì)胞的分裂進入到子代細(xì)胞中,。在這一段時間內(nèi),，外源基因在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)錄翻譯，得到少量的蛋白,。根據(jù)使用的載體不同,，收集目的基因/蛋白進行檢測的時間不同，通常在轉(zhuǎn)染后48h,，目的蛋白的表達水平最高,。瞬時轉(zhuǎn)染的特點是短時間內(nèi)進行蛋白的小量制備，滿足后續(xù)的實驗要求,。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是外源DNA整合到細(xì)胞基因組中,，成為細(xì)胞基因組的一部分從而得以復(fù)制,，隨著細(xì)胞分裂，子代細(xì)胞也同樣表達外源基因,，這就是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的標(biāo)志,。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是建立在瞬時轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)上的，先對細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染,，再對得到的細(xì)胞池進行篩選,，篩選標(biāo)記是抗生素，熒光報告基團等,，通常需要2-3周的篩選時間,，由此形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系,。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的特點是能夠得到蛋白的大量,、長期生產(chǎn)，滿足后續(xù)的一系列體內(nèi)體外的表型實驗,。

轉(zhuǎn)染方式

考慮到轉(zhuǎn)染效率是影響細(xì)胞實驗的重要因素,，因此選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染方式很關(guān)鍵。下面我們介紹一下常見的轉(zhuǎn)染方式,。

細(xì)胞由帶負(fù)電荷的磷脂雙分子層構(gòu)成,，對于也帶負(fù)電荷的核酸片段（DNA和RNA）來說是不可透過的屏障，因此研究人員開發(fā)了很多方法能使核酸穿透細(xì)胞膜進入胞內(nèi),，大致分為三類：

細(xì)胞由帶負(fù)電荷的磷脂雙分子層構(gòu)成，對于也帶負(fù)電荷的核酸片段（DNA和RNA）來說是不可透過的屏障,，因此研究人員開發(fā)了很多方法能使核酸穿透細(xì)胞膜進入胞內(nèi),，大致分為三類：

轉(zhuǎn)染的影響因素：

轉(zhuǎn)染過程中許多因素會影響轉(zhuǎn)染效率：如細(xì)胞類型；細(xì)胞密度,；質(zhì)粒大小,、質(zhì)粒純度；血清；轉(zhuǎn)染試劑等,。轉(zhuǎn)染實驗中,，以下幾個因素進行調(diào)整和優(yōu)化：

1. 轉(zhuǎn)染前的細(xì)胞狀態(tài)和密度

轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度以 50-80%最佳，細(xì)胞密度過高會嚴(yán)重影響細(xì)胞狀態(tài)和轉(zhuǎn)染效率（周期進程阻滯,，凋亡增加等）,。同時支原體污染會嚴(yán)重降低細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，因此轉(zhuǎn)染前可用環(huán)丙沙星處理細(xì)胞以除去支原體,。

2. 轉(zhuǎn)染時的質(zhì)粒純度

如果提取的質(zhì)粒不純,，如帶少量鹽離子，蛋白,、代謝物污染等都會顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成,；而含有內(nèi)毒素的質(zhì)粒對細(xì)胞存在很大的毒性作用（一般用去內(nèi)毒素的提取試劑盒）?？股匾话銓φ婧思?xì)胞無毒,，但轉(zhuǎn)染過程中細(xì)胞通透性增加，會使抗生素進入細(xì)胞,，從而降低細(xì)胞活性,，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低,。

3. 轉(zhuǎn)染后的篩選時間

轉(zhuǎn)染后篩選不能太早或太晚,，因為轉(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷大，增殖較慢,，太晚會被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒,，最終導(dǎo)致篩選不出陽性克隆。一般要在轉(zhuǎn)染后48h之后開始加抗生素篩選,。

4. DNA 與轉(zhuǎn)染試劑的比例

許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化 DNA 與轉(zhuǎn)染試劑的比例,。不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同，不同轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染效率差別很大,，通常需要根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說明書進行預(yù)實驗,，選擇合適濃度的外源DNA或RNA，調(diào)整外源核酸片段和轉(zhuǎn)染試劑的比例,。