轉(zhuǎn)染(transfection)是真核細胞主動或被動導入外源核酸片段（DNA或RNA）而獲得新的表型的過程。轉(zhuǎn)染后的細胞會產(chǎn)生重組蛋白,，或者特異性的增強/抑制細胞中的基因表達,。轉(zhuǎn)染后的檢測主要包括基因水平和蛋白水平的檢測,。一定時間后收集轉(zhuǎn)染處理后的細胞，采用超聲或酶解的方法破碎細胞,，離心得到上清,。針對基因水平，使用普通 PCR 或 RT-PCR 進行驗證,，蛋白水平,，使用 western blot 檢測，簡單,，快速,，準確。

轉(zhuǎn)染的類型

根據(jù)導入的核酸存在于宿主細胞的時間長短,，可以分為瞬轉(zhuǎn)和穩(wěn)轉(zhuǎn),。根據(jù)轉(zhuǎn)染方式可以分為化學方法，生物方法,，物理方法,。

瞬時轉(zhuǎn)染是指將構(gòu)建好的質(zhì)粒或者siRNA通過某種方式導入到哺乳動物細胞內(nèi)（常用的工具細胞 HEK293 細胞）,，該外源核酸片段不整合到細胞自身的基因組上,。隨著細胞的生長分裂，外源基因會逐漸丟失,，在細胞內(nèi)能夠存在 3-4 天,，無法隨著細胞的分裂進入到子代細胞中。在這一段時間內(nèi),，外源基因在細胞內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)錄翻譯,，得到少量的蛋白。根據(jù)使用的載體不同,，收集目的基因/蛋白進行檢測的時間不同,，通常在轉(zhuǎn)染后48h，目的蛋白的表達水平最高,。瞬時轉(zhuǎn)染的特點是短時間內(nèi)進行蛋白的小量制備,，滿足后續(xù)的實驗要求。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是外源DNA整合到細胞基因組中,，成為細胞基因組的一部分從而得以復制,，隨著細胞分裂，子代細胞也同樣表達外源基因，這就是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的標志,。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是建立在瞬時轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)上的,，先對細胞進行轉(zhuǎn)染，再對得到的細胞池進行篩選,，篩選標記是抗生素,，熒光報告基團等，通常需要2-3周的篩選時間,，由此形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的特點是能夠得到蛋白的大量,、長期生產(chǎn),，滿足后續(xù)的一系列體內(nèi)體外的表型實驗。

轉(zhuǎn)染方式

考慮到轉(zhuǎn)染效率是影響細胞實驗的重要因素,，因此選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染方式很關(guān)鍵,。下面我們介紹一下常見的轉(zhuǎn)染方式。

細胞由帶負電荷的磷脂雙分子層構(gòu)成,，對于也帶負電荷的核酸片段（DNA和RNA）來說是不可透過的屏障,，因此研究人員開發(fā)了很多方法能使核酸穿透細胞膜進入胞內(nèi)，大致分為三類：

細胞由帶負電荷的磷脂雙分子層構(gòu)成,，對于也帶負電荷的核酸片段（DNA和RNA）來說是不可透過的屏障，因此研究人員開發(fā)了很多方法能使核酸穿透細胞膜進入胞內(nèi),，大致分為三類：

轉(zhuǎn)染的影響因素：

轉(zhuǎn)染過程中許多因素會影響轉(zhuǎn)染效率：如細胞類型,；細胞密度；質(zhì)粒大小,、質(zhì)粒純度,；血清；轉(zhuǎn)染試劑等,。轉(zhuǎn)染實驗中,，以下幾個因素進行調(diào)整和優(yōu)化：

1. 轉(zhuǎn)染前的細胞狀態(tài)和密度

轉(zhuǎn)染時細胞密度以 50-80%最佳,，細胞密度過高會嚴重影響細胞狀態(tài)和轉(zhuǎn)染效率（周期進程阻滯，凋亡增加等）,。同時支原體污染會嚴重降低細胞的轉(zhuǎn)染效率,，因此轉(zhuǎn)染前可用環(huán)丙沙星處理細胞以除去支原體。

2. 轉(zhuǎn)染時的質(zhì)粒純度

如果提取的質(zhì)粒不純,，如帶少量鹽離子,，蛋白、代謝物污染等都會顯著影響轉(zhuǎn)染復合物的有效形成,；而含有內(nèi)毒素的質(zhì)粒對細胞存在很大的毒性作用（一般用去內(nèi)毒素的提取試劑盒）,。抗生素一般對真核細胞無毒,，但轉(zhuǎn)染過程中細胞通透性增加,，會使抗生素進入細胞，從而降低細胞活性,，導致轉(zhuǎn)染效率降低。

3. 轉(zhuǎn)染后的篩選時間

轉(zhuǎn)染后篩選不能太早或太晚,，因為轉(zhuǎn)染了外源基因的細胞代謝負荷大,，增殖較慢，太晚會被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細胞所淹沒,，最終導致篩選不出陽性克隆,。一般要在轉(zhuǎn)染后48h之后開始加抗生素篩選。

4. DNA 與轉(zhuǎn)染試劑的比例

許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化 DNA 與轉(zhuǎn)染試劑的比例,。不同細胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同,，不同轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染效率差別很大，通常需要根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說明書進行預實驗,，選擇合適濃度的外源DNA或RNA,，調(diào)整外源核酸片段和轉(zhuǎn)染試劑的比例。