到了復(fù)蘇細(xì)胞開始實驗的環(huán)節(jié)了 ,，以下是整理的一些復(fù)蘇細(xì)胞的注意事項：

1. 細(xì)胞儲存在液氮中,，溫度達(dá)-196℃，理論上儲存時間是無限的,。只要一直在液氮,，凍存沒有問題，那么復(fù)蘇也不會出現(xiàn)很大的問題,，不存在有效期限,，細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，復(fù)蘇一定越快越好,，實驗證明這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力,。

2. 取細(xì)胞時應(yīng)做好防護(hù)措施，帶好防凍手套,，護(hù)目鏡,。細(xì)胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升,，可導(dǎo)致爆炸,。

3. 必須在1-2min內(nèi)使凍存液*融化，復(fù)蘇溫度太慢,，會造成細(xì)胞的損傷,。如果凍存管的壁較厚，隔熱效果較好,，可以適當(dāng)提高水浴溫度（37℃~40℃）,。凍存液建議選用進(jìn)口產(chǎn)品，DMSO含量為5%,并添加海藻糖和丙二醇以及細(xì)胞生長因子,，細(xì)胞成活更高.

4. 提前預(yù)定超凈臺,，減少復(fù)蘇后插在冰盒里等待的時間。復(fù)蘇后若需要長時間（>1h）等待,，建議往離心管加15ml以上培養(yǎng)基搖勻以稀釋DMSO給細(xì)胞帶來的毒性作用,。對于不離心直接加入培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞，培養(yǎng)基的加入量是個需要考慮的問題,。主要涉及DMSO的濃度,，一般DMSO含量為5%的細(xì)胞，在7.5ml的*培養(yǎng)基里不受影響,，細(xì)胞可正常生長（這招很管用哦）,。

5. 關(guān)于細(xì)胞溶解后，是否需要離心的問題,，需要根據(jù)特定的細(xì)胞情況而定,。主要有兩種方式。一種是解凍后的細(xì)胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng),，第二天換液（后貼壁后即換液）,。因為離心的目的是兩個,，去除DMSO，去除死細(xì)胞,，這個是標(biāo)準(zhǔn)流程,。但對一般人來說，把握不好離心轉(zhuǎn)速和時間,，轉(zhuǎn)的不夠活細(xì)胞沉底的少,，細(xì)胞就全被扔掉了，轉(zhuǎn)過了活細(xì)胞會受壓過大,，死亡,。此外在操作過程中容易污染。另一種是須離心后,，將凍存液倒干凈,，且一定要倒干凈。懸浮細(xì)胞和貼壁比較慢的細(xì)胞一定要離心,，比如NCI-H716,和LNCAP等特殊培養(yǎng)方式的細(xì)胞,。

6. 有些細(xì)胞復(fù)蘇后一星期才有起色，切忌要有耐心,，不要換液,，耐心等待,，兩周后再做決定,。不要復(fù)蘇三四天后，細(xì)胞沒有任何動靜,，認(rèn)為失敗,，倒掉所有細(xì)胞。MLO-Y4就有這種毛病,，技術(shù)復(fù)蘇后各種花式優(yōu)待它就是不長,，然后大家都不想理它了，放了一周多拿出來,，竟然長滿了,。