這篇文章Kaustubh Kishor Jadhav撰寫的,，今天先分享的是他的上一段,，關(guān)于細(xì)胞支原體污染的原因和怎么檢測細(xì)胞支原體污染，他是米高梅生物科學(xué)與技術(shù)研究所的研究助理,。

如果你正在閱讀這篇文章,，如果你的實(shí)驗(yàn)室里有支原體，不要驚訝,。因?yàn)樗鼈兇嬖谟诖蠖鄶?shù)細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)施,、組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中，是每個細(xì)胞培養(yǎng)工作者必須解決的問題,。據(jù)估計(jì),，高達(dá)60%的細(xì)胞培養(yǎng)污染是支原體污染（Uphoff，2002年統(tǒng)計(jì)）,。

支原體被認(rèn)為是最是簡單,、最小的細(xì)菌之一。缺乏堅(jiān)硬的細(xì)胞壁使它們對抗生素和抗菌藥物如青霉素和鏈霉素產(chǎn)生耐藥性,。支原體可以通過過濾器,，因?yàn)樗軌蜃兂扇魏涡螤钜责じ皆诩?xì)胞壁上。

支原體污染的原因

支原體通過各種難以追蹤的來源進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng),。這些包括實(shí)驗(yàn)室人員,、血清、細(xì)胞培養(yǎng)基,、水浴,、培養(yǎng)箱等。人類支原體污染是上述污染的最大來源,。污染物可以通過臟衣服,、實(shí)驗(yàn)服、以及層流氣流附近的會語、頭皮屑,、打噴嚏,、咳嗽等傳播。此外,，無論在哪里保存細(xì)胞培養(yǎng)物,，持續(xù)不斷的個體流動都會增加污染的風(fēng)險(xiǎn)。

由于實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備落后以及節(jié)約成本等原因,，支原體可以通過交叉污染從這些來源傳播,，這包括對多個細(xì)胞系重復(fù)使用移液管，而不是使用一次性移液管或重復(fù)使用手套,。血清也是支原體污染的來源,。由于其渾濁的性質(zhì)，污染是很難檢測到的血清,，這是較為常用的每種細(xì)胞培養(yǎng),。重復(fù)使用同一瓶血清可促進(jìn)支原體的生長。血清營養(yǎng)豐富,，也是支原體增殖的最佳來源,。另外，它是在高壓滅菌后添加到培養(yǎng)基中的,，因此,，不能保證血清無污染。

在層流氣流倉中工作時（說話或移液時）產(chǎn)生的氣溶膠也是造成污染的主要原因之一,。在傳代培養(yǎng)過程中,，這些產(chǎn)生的氣溶膠將進(jìn)入培養(yǎng)基，如果細(xì)胞系暴露時間較長,，這些氣溶膠將從空氣中進(jìn)入細(xì)胞,。這些氣溶膠肉眼看不見，因此在導(dǎo)致污染之前無法被檢測到,。

問題的另一個來源是用于傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)基,，它有液體和粉末兩種形式。由于處理不當(dāng)或?qū)嶒?yàn)室環(huán)境不好,，支原體可以通過這種粉狀培養(yǎng)基傳播,。過濾不能確保*滅菌，因?yàn)橹гw甚至可以逃逸0.2微米的過濾器,。

支原體可以在干燥狀態(tài)下保持較長時間,。當(dāng)它們接觸到營養(yǎng)源時，很快就會開始增殖,。一旦它們出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中,，就很難*。你可以抑制支原體的生長，但不能**它,。當(dāng)支原體出現(xiàn)在培養(yǎng)基中時,，丟棄培養(yǎng)源是一個很好的選擇（除非培養(yǎng)源不可替代或價格昂貴）。

怎么檢測細(xì)胞支原體

用肉眼或光學(xué)顯微鏡檢測支原體是非常困難的,，那么你怎么知道它在那里呢,？您可以使用PCR的檢測、DNA染色,、熒光標(biāo)記、瓊脂平板等,。明智地選擇下面列出的任何一種技術(shù),，并始終使用第二次分析來確定。在檢測支原體之前,，細(xì)胞應(yīng)連續(xù)培養(yǎng)至少兩周,，以便有時間讓低濃度的污染物生長。對于試驗(yàn),，取樣前至少兩天或三天不應(yīng)更換培養(yǎng)基（Uphoff和Drexler,，2011）。

軟瓊脂培養(yǎng)被認(rèn)為是檢測支原體的“金標(biāo)準(zhǔn)",。在這種方法中,，細(xì)胞培養(yǎng)的上清液被加入液體或半固體培養(yǎng)基（含有支原體生長所必需的營養(yǎng)素）。受感染的細(xì)胞在含有培養(yǎng)基的瓊脂平板上都會生長,。支原體菌落在瓊脂平板上很容易看到,。除少數(shù)支原體外，該方法能檢測大多數(shù)支原體,。

另一種用于支原體檢測的方法是PCR,。在這項(xiàng)技術(shù)中，針對各種常見感染支原體的16sRNA基因的PCR引物被使用,。廣泛的引物包含幾乎所有可感染的支原體,。過程中使用的引物要么是物種/基因特異性的，要么是通用的,。該方法快速,、高效、可靠且效益高（Sung,，2006）,。

顯色法檢測細(xì)胞支原體。一旦檢測到支原體,，試劑就會引發(fā)一系列的化學(xué)反應(yīng),，從而引起明顯的顏色變化。該方法靈敏度高，特異性低（Degeling,，2012）,。

生物發(fā)光檢測試劑盒可從不同的生物技術(shù)公司獲得，這些公司是基于酶的支原體檢測試劑盒,。這些試劑盒檢測的支原體酶不是由真核細(xì)胞合成,。首先，試劑盒的成分使支原體破裂,，然后使用特定的酶來觸發(fā)產(chǎn)生發(fā)光的細(xì)胞機(jī)制,，然后通過光度計(jì)檢測到。

感染培養(yǎng)基中可加入非特異性DNA染色劑檢測支原體,。當(dāng)在熒光顯微鏡下觀察時,，支原體DNA除了細(xì)胞DNA外，還以小簇的形式出現(xiàn),。

熒光DNA染色是另一種DNA染色方法,。這種方法使用像DAPI和hoechst33258這樣的DNA染色劑來染色所有的DNA。在這個過程中需要一些專業(yè)知識,，因?yàn)榻Y(jié)果解釋可能很困難,。支原體的低密度、其他細(xì)菌的污染或這些細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)胞外熒光信號都會妨礙正確的結(jié)果解釋,。此外,，來自核區(qū)的信號使支原體的檢測變得困難（Ligasová，2019）,。這種方法一般不建議使用,。