很多時候，我們千辛萬苦地染出了一張張漂亮的免疫組化片子。但是卻不知道如何正確地分析，得出理想的結(jié)果。這實在是一件憾事,。其實，免疫組化結(jié)果分析的 protocol 教科書和實驗手冊上面都有,。今天主要談?wù)剳?yīng)該注意的一些事項和技巧,，并且有獨門絕招獻上，都是干貨喲,。

對照染色 

和做實驗的時候必須設(shè)立對照組一樣,，免疫組化也必須設(shè)立對照染色。沒有對照染色的免疫組化結(jié)果是不可信的,。對照一般有陽性組織對照,，陰性組織對照，陰性試劑對照，自身對照,。一般來說,，有一個陽性組織對照和一個陰性組織對照就足夠了。 

定位 

抗原表達必須在特定部位,。如 LCA 應(yīng)定位在細胞膜上,；CK 應(yīng)定位在細胞漿內(nèi)；PCNA 及 p53 蛋白應(yīng)定位在細胞核內(nèi)等等,。不在抗原所在部位的陽性著色,，不能視為確切的陽性結(jié)果。有可能是非特異性染色或者假陽性,。不能確定怎么辦,？這就要用到上一段提到的對照染色了。

半定位 

現(xiàn)在一般用圖像分析系統(tǒng)進行定量,。如果你的實驗室不幸沒有那么高大上的話,，就只好趕鴨子上架，用肉眼定一下量了,。因為人為主觀性比較強,，所以只能稱作半定量。免疫組化的半定量一般就分為三級：弱（+）,，中（++）,，強（+++）。以綠色免疫熒光為例,，則表現(xiàn)為淺綠色熒光,、明顯綠色熒光和亮綠色耀眼熒光。弱（+）=1,，中（++）=2,，強（+++）=3,。至少隨機觀察 5-10 個 HPF,。然后根據(jù)（+）% x 1 +（++）% x 2 +（+++）% x 3 計算出數(shù)值；總數(shù)值 <1.0 者為（+）,，1.0-1.5 者為(++), >1.5 者為(+++),。

圖像分析儀 

如果要進行精確定量的話，就要用到圖像分析儀,。圖像分析儀類型很多,。這里就不一一介紹了。其實最想推薦的是一款圖像分析軟件：Image J,。這是 NIH 開發(fā)的免費軟件,。一般的免疫組化結(jié)果分析用它就綽綽有余了。網(wǎng)上可以免費下載。其界面非常簡潔,。

現(xiàn)在,，根據(jù)一個實例來看看如何用 Image J 來進行圖像分析。如我們有一張細胞的免疫熒光染色的照片,。那么,，如何用 Image J 來計數(shù)細胞的個數(shù)呢？

首先,，要把彩色的圖像轉(zhuǎn)換成黑白圖像,。步驟如下：Image→Type→16-bit。轉(zhuǎn)換成黑白圖像后,，將要計數(shù)的部分用高亮標示出來,。步驟如下：Image→Adjust→Threshold。然后拖動鼠標,，直到所有的細胞被標示出來,。有時候 2 個細胞靠得比較緊密，會被計數(shù)為 1 個細胞,。這個時候可以采用 Image J 的水洗功能,。步驟如下：Image→Binary→Watershed。這些是本來計數(shù)成一個的細胞,，經(jīng)過水洗之后,，更加精確地被計數(shù)成了 2 個細胞。

然后,，就可以正式開始分析了,。步驟如下：Analyze→Analyze Particles。在得出最后的結(jié)果之前,，還有一些選項需要選擇,。如果想要計數(shù)全部的細胞，那么 Size 項里面選擇“0-infinity",。 Circularity 的默認值為“0.00-1.00",。一般就取默認值。軟件自動測量了每個細胞的大小,。這里因為是二維圖像,，所以就是每個細胞的面積。

免疫組化是個苦活,，時間長,，步驟多，還要經(jīng)常接觸有毒致癌物質(zhì),。大家辛辛苦苦染出了漂亮的片子,，最后都希望得出自己想要的結(jié)果,。以上介紹了一些心得體會。希望廣大的同學(xué)們都能做出自己想要的結(jié)果,，早點發(fā)文章,。