很多時(shí)候,，我們千辛萬(wàn)苦地染出了一張張漂亮的免疫組化片子,。但是卻不知道如何正確地分析，得出理想的結(jié)果,。這實(shí)在是一件憾事,。其實(shí)，免疫組化結(jié)果分析的 protocol 教科書(shū)和實(shí)驗(yàn)手冊(cè)上面都有,。今天主要談?wù)剳?yīng)該注意的一些事項(xiàng)和技巧,，并且有獨(dú)門(mén)絕招獻(xiàn)上，都是干貨喲,。

對(duì)照染色 

和做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候必須設(shè)立對(duì)照組一樣,，免疫組化也必須設(shè)立對(duì)照染色。沒(méi)有對(duì)照染色的免疫組化結(jié)果是不可信的,。對(duì)照一般有陽(yáng)性組織對(duì)照,，陰性組織對(duì)照，陰性試劑對(duì)照,，自身對(duì)照,。一般來(lái)說(shuō)，有一個(gè)陽(yáng)性組織對(duì)照和一個(gè)陰性組織對(duì)照就足夠了,。 

定位 

抗原表達(dá)必須在特定部位,。如 LCA 應(yīng)定位在細(xì)胞膜上；CK 應(yīng)定位在細(xì)胞漿內(nèi),；PCNA 及 p53 蛋白應(yīng)定位在細(xì)胞核內(nèi)等等,。不在抗原所在部位的陽(yáng)性著色,，不能視為確切的陽(yáng)性結(jié)果。有可能是非特異性染色或者假陽(yáng)性,。不能確定怎么辦,？這就要用到上一段提到的對(duì)照染色了。

半定位 

現(xiàn)在一般用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量,。如果你的實(shí)驗(yàn)室不幸沒(méi)有那么高大上的話,，就只好趕鴨子上架，用肉眼定一下量了,。因?yàn)槿藶橹饔^性比較強(qiáng),，所以只能稱作半定量。免疫組化的半定量一般就分為三級(jí)：弱（+）,，中（++）,，強(qiáng)（+++）。以綠色免疫熒光為例,，則表現(xiàn)為淺綠色熒光,、明顯綠色熒光和亮綠色耀眼熒光。弱（+）=1,，中（++）=2,，強(qiáng)（+++）=3。至少隨機(jī)觀察 5-10 個(gè) HPF,。然后根據(jù)（+）% x 1 +（++）% x 2 +（+++）% x 3 計(jì)算出數(shù)值,；總數(shù)值 <1.0 者為（+），1.0-1.5 者為(++), >1.5 者為(+++),。

圖像分析儀 

如果要進(jìn)行精確定量的話,，就要用到圖像分析儀。圖像分析儀類型很多,。這里就不一一介紹了,。其實(shí)最想推薦的是一款圖像分析軟件：Image J。這是 NIH 開(kāi)發(fā)的免費(fèi)軟件,。一般的免疫組化結(jié)果分析用它就綽綽有余了,。網(wǎng)上可以免費(fèi)下載。其界面非常簡(jiǎn)潔,。

現(xiàn)在,，根據(jù)一個(gè)實(shí)例來(lái)看看如何用 Image J 來(lái)進(jìn)行圖像分析。如我們有一張細(xì)胞的免疫熒光染色的照片,。那么,，如何用 Image J 來(lái)計(jì)數(shù)細(xì)胞的個(gè)數(shù)呢？

首先，要把彩色的圖像轉(zhuǎn)換成黑白圖像,。步驟如下：Image→Type→16-bit,。轉(zhuǎn)換成黑白圖像后，將要計(jì)數(shù)的部分用高亮標(biāo)示出來(lái),。步驟如下：Image→Adjust→Threshold,。然后拖動(dòng)鼠標(biāo)，直到所有的細(xì)胞被標(biāo)示出來(lái),。有時(shí)候 2 個(gè)細(xì)胞靠得比較緊密,，會(huì)被計(jì)數(shù)為 1 個(gè)細(xì)胞。這個(gè)時(shí)候可以采用 Image J 的水洗功能,。步驟如下：Image→Binary→Watershed,。這些是本來(lái)計(jì)數(shù)成一個(gè)的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)水洗之后,，更加精確地被計(jì)數(shù)成了 2 個(gè)細(xì)胞。

然后,，就可以正式開(kāi)始分析了,。步驟如下：Analyze→Analyze Particles。在得出最后的結(jié)果之前,，還有一些選項(xiàng)需要選擇,。如果想要計(jì)數(shù)全部的細(xì)胞，那么 Size 項(xiàng)里面選擇“0-infinity",。 Circularity 的默認(rèn)值為“0.00-1.00",。一般就取默認(rèn)值。軟件自動(dòng)測(cè)量了每個(gè)細(xì)胞的大小,。這里因?yàn)槭嵌S圖像,，所以就是每個(gè)細(xì)胞的面積。

免疫組化是個(gè)苦活,，時(shí)間長(zhǎng),，步驟多，還要經(jīng)常接觸有毒致癌物質(zhì),。大家辛辛苦苦染出了漂亮的片子,，最后都希望得出自己想要的結(jié)果。以上介紹了一些心得體會(huì),。希望廣大的同學(xué)們都能做出自己想要的結(jié)果,，早點(diǎn)發(fā)文章。