相信大家對 IHC 一定不陌生,，世界那么大，實驗方法層出不窮,，但是免疫組化卻是經典中的經典,，想看看別的高大上的技術？不急,，我們先來復習復習免疫組化,。

免疫組化，免疫組織化學技術（immunohistochemistry）,，是一項利用抗原抗體反應,，通過使標記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內抗原，對蛋白定位,，定性的實驗技術,。

免疫組化主要用的是組織標本和細胞標本兩大類，組織標本包括石蠟切片（病理切片和組織芯片）和冰凍切片,。石蠟切片,，對組織形態(tài)保存好，保存時間也長,，雖然對組織抗原暴露有影響,，但可以抗原修復，所以石蠟切片仍然是首先選擇的標本制作方法,。

好了,，重點來了，下面是免疫組化步驟和經驗，各位看官不要錯過哦,！

① 在 60°烤箱烤片 30~60min,，這一步是為了使蠟片水分蒸發(fā)和石蠟融化，好讓組織切片牢固貼在玻片上,。做切片是免疫組化的前提切片子最好是找專業(yè)培訓過的人員切片，片子的厚薄均勻,，切片的完整,，無褶無刀痕?？佳械豆さ臅r候,。

② 脫蠟水化，依次放入二甲苯Ⅰ,、Ⅱ,、Ⅲ各 10min，乙醇梯度（高至低）各 2min,，水,。然后用自來水洗一下，但不要直接對著切片沖洗,。

③ 抗原修復,，用的是高壓熱修復，ph6.0 的檸檬酸鹽緩沖液,，一定要全部浸泡切片,，等高壓鍋冒氣后 5min 結束，自然冷卻,，溫度驟降可能引起脫片哦,。3%H2O2 避光浸泡 15min （當然有的朋友用 EDTA 修復或者說使用微波修復等方法也是可以的，但是每一種抗體對不同的抗原修復方法的反應是不一樣的,，得具體對待,。） 

④ 這一步有神器，用“組傳"的免疫組化油筆圍繞組織畫圈,，接下來就能看見它的功效了,。 PBS 洗 5min x 3 次。PBS 會被鎖在畫的圈中,，不會流干,，保證不干片。 

⑤ 滴加 5%BSA （BSA 用 PBS 溶）稀釋的一抗,，每個組織約 20ul,，用 200ul 的槍頭尖的一端抹平，4°過夜或者 37°1~2h,，這里用的是第二種方法,。（每種組織大小不一樣，面積大概 1 乘 1 的可以 20ul 就夠了,，對于類似 NPC 的組織就沒必要這么大了,，關于一抗的問題，個人建議 4°過夜的方法,，當然 37°1~2hour 也是可以的,，兩種方法沒法說誰好誰不好，不同的抗體對方法的敏感性是不一樣的）再次 PBS 洗 5min x 3 次,。 

⑥ 滴加二抗,，一滴每個，用 200ul 的槍頭尖的一端抹平,，室溫靜置 30min,。（貨號 GK500705 的二抗檢測試劑盒，很好用,，極力推薦,。）

⑦ 再次 PBS 洗 5min x 3 次

⑧ DAB- H2O2 顯色 10min。（B：C=1:50,，25ul 每個,，現配現用），在這時要觀察,，如果染色明顯,，不到 10 分鐘即可蒸餾水洗終止顯色，但是一般超過 20min 都不會有什么好結果,。 

⑨ Mayer 蘇木素染色 30s,，水洗，鹽酸酒精分化 3s,，流水浸 15min 

⑩ 脫水,乙酸 2min,，乙醇梯度（低至高）各 2min，二甲苯 5min 

? 中性樹膠封片,。

結果分析：

鏡下細胞核呈藍色,，陽性結果呈深淺不一的棕色

結果分析主要有兩種方法，陽性著色細胞計數法和評分法,。前者是在 40*光鏡下,，隨機 10 個視野下計數陽性著色細胞；后者則是在光學顯微鏡下按染色程度（0 分陰性著色,，1 分 淡黃色,，2 分淺褐色，3 分深褐色）和陽性范圍（1 分 0-25%，2 分 26-50%,，3 分 51-75%,，4 分 76-100%）評分，最終分數相加,。

再來看下反面教材 

較為常見的非特異性著色,；還有背景過深的。要避免成為上述的兩種典型,，做出一張可以見老板的結果,，每步都要且做且思考。

啰嗦幾句：

1,、脫蠟和脫水的步驟呢，每個實驗室都有自己獨到的方法,，用的乙醇的梯度不*相同,，大家按照自己的習慣那套來就好。但要注意,，脫蠟和水化不全引起局灶性反應,，會導致非特異性著色。 

2,、一定要防止干片,！干片也很容易引起非特異性著色。 

3,、在用槍頭抹平抗體時,，要盡量將槍頭放平，用斜面而不要用尖頭接觸組織,，這一步要輕柔小心,，可能你只是輕輕刮到幾下，但鏡下組織就變得亂七八糟的了（別問我是怎么知道的） 

4,、PBS 在洗的時候,，不要對著組織沖洗，會脫片,。小編的方法是將沖洗著力點放在玻片的邊緣,，讓液體自然流向組織。 

5,、一抗?jié)舛戎陵P重要,，這直接影響了最終的結果，摸條件時設置一抗?jié)舛忍荻?。建議同時設置一個陽性對照,，可以排除一抗之外的操作問題。 

6、背景染色過深的話,，就要考慮一抗?jié)舛冗^高或者一抗時間過長,，顯色時間過長這些問題了。

7,、降低組織非特異性染色,，可以縮短一抗，二抗的時間,，稀釋抗體,，也可以增加幾次 PBS 沖洗?；蛘咧苯佑脝慰?。

免疫組化往往作為檢測某蛋白在組織的表達情況出現在預實驗中，免疫組化的結果可能將直接影響課題的后續(xù)設計和進展,。如果說我們的科研課題是一個大世界的話,，免疫組化是我們看向這個世界的敲門磚。做好免疫組化,，我們一起去更大的世界看看,！