相信大家對(duì) IHC 一定不陌生,，世界那么大,，實(shí)驗(yàn)方法層出不窮，但是免疫組化卻是經(jīng)典中的經(jīng)典,，想看看別的高大上的技術(shù),？不急,，我們先來(lái)復(fù)習(xí)復(fù)習(xí)免疫組化。

免疫組化,，免疫組織化學(xué)技術(shù)（immunohistochemistry）,，是一項(xiàng)利用抗原抗體反應(yīng)，通過(guò)使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原,，對(duì)蛋白定位,，定性的實(shí)驗(yàn)技術(shù),。

免疫組化主要用的是組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類，組織標(biāo)本包括石蠟切片（病理切片和組織芯片）和冰凍切片,。石蠟切片,，對(duì)組織形態(tài)保存好,，保存時(shí)間也長(zhǎng),，雖然對(duì)組織抗原暴露有影響,，但可以抗原修復(fù),，所以石蠟切片仍然是首先選擇的標(biāo)本制作方法。

好了,，重點(diǎn)來(lái)了,，下面是免疫組化步驟和經(jīng)驗(yàn),，各位看官不要錯(cuò)過(guò)哦,！

① 在 60°烤箱烤片 30~60min,，這一步是為了使蠟片水分蒸發(fā)和石蠟融化,，好讓組織切片牢固貼在玻片上,。做切片是免疫組化的前提切片子最好是找專業(yè)培訓(xùn)過(guò)的人員切片，片子的厚薄均勻,，切片的完整,，無(wú)褶無(wú)刀痕?？佳械豆さ臅r(shí)候,。

② 脫蠟水化,，依次放入二甲苯Ⅰ,、Ⅱ、Ⅲ各 10min,，乙醇梯度（高至低）各 2min,，水。然后用自來(lái)水洗一下,，但不要直接對(duì)著切片沖洗,。

③ 抗原修復(fù)，用的是高壓熱修復(fù),，ph6.0 的檸檬酸鹽緩沖液,，一定要全部浸泡切片，等高壓鍋冒氣后 5min 結(jié)束,，自然冷卻,，溫度驟降可能引起脫片哦。3%H2O2 避光浸泡 15min （當(dāng)然有的朋友用 EDTA 修復(fù)或者說(shuō)使用微波修復(fù)等方法也是可以的,，但是每一種抗體對(duì)不同的抗原修復(fù)方法的反應(yīng)是不一樣的,，得具體對(duì)待。） 

④ 這一步有神器,，用“組傳"的免疫組化油筆圍繞組織畫(huà)圈,，接下來(lái)就能看見(jiàn)它的功效了,。 PBS 洗 5min x 3 次。PBS 會(huì)被鎖在畫(huà)的圈中,，不會(huì)流干,，保證不干片,。 

⑤ 滴加 5%BSA （BSA 用 PBS 溶）稀釋的一抗,，每個(gè)組織約 20ul，用 200ul 的槍頭尖的一端抹平,，4°過(guò)夜或者 37°1~2h,，這里用的是第二種方法,。（每種組織大小不一樣,，面積大概 1 乘 1 的可以 20ul 就夠了，對(duì)于類似 NPC 的組織就沒(méi)必要這么大了,，關(guān)于一抗的問(wèn)題,，個(gè)人建議 4°過(guò)夜的方法,，當(dāng)然 37°1~2hour 也是可以的，兩種方法沒(méi)法說(shuō)誰(shuí)好誰(shuí)不好,，不同的抗體對(duì)方法的敏感性是不一樣的）再次 PBS 洗 5min x 3 次。 

⑥ 滴加二抗,，一滴每個(gè),，用 200ul 的槍頭尖的一端抹平,，室溫靜置 30min,。（貨號(hào) GK500705 的二抗檢測(cè)試劑盒,，很好用，極力推薦,。）

⑦ 再次 PBS 洗 5min x 3 次

⑧ DAB- H2O2 顯色 10min,。（B：C=1:50，25ul 每個(gè),，現(xiàn)配現(xiàn)用）,，在這時(shí)要觀察，如果染色明顯,，不到 10 分鐘即可蒸餾水洗終止顯色,，但是一般超過(guò) 20min 都不會(huì)有什么好結(jié)果。 

⑨ Mayer 蘇木素染色 30s,，水洗,，鹽酸酒精分化 3s，流水浸 15min 

⑩ 脫水,乙酸 2min,，乙醇梯度（低至高）各 2min,，二甲苯 5min 

? 中性樹(shù)膠封片。

結(jié)果分析：

鏡下細(xì)胞核呈藍(lán)色,，陽(yáng)性結(jié)果呈深淺不一的棕色

結(jié)果分析主要有兩種方法,，陽(yáng)性著色細(xì)胞計(jì)數(shù)法和評(píng)分法,。前者是在 40*光鏡下，隨機(jī) 10 個(gè)視野下計(jì)數(shù)陽(yáng)性著色細(xì)胞,；后者則是在光學(xué)顯微鏡下按染色程度（0 分陰性著色，1 分 淡黃色,，2 分淺褐色,，3 分深褐色）和陽(yáng)性范圍（1 分 0-25%，2 分 26-50%,，3 分 51-75%,，4 分 76-100%）評(píng)分，最終分?jǐn)?shù)相加,。

再來(lái)看下反面教材 

較為常見(jiàn)的非特異性著色,；還有背景過(guò)深的。要避免成為上述的兩種典型,，做出一張可以見(jiàn)老板的結(jié)果,，每步都要且做且思考。

啰嗦幾句：

1,、脫蠟和脫水的步驟呢,，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都有自己獨(dú)到的方法，用的乙醇的梯度不*相同,，大家按照自己的習(xí)慣那套來(lái)就好,。但要注意，脫蠟和水化不全引起局灶性反應(yīng),，會(huì)導(dǎo)致非特異性著色,。 

2、一定要防止干片,！干片也很容易引起非特異性著色,。 

3、在用槍頭抹平抗體時(shí),，要盡量將槍頭放平,，用斜面而不要用尖頭接觸組織，這一步要輕柔小心,，可能你只是輕輕刮到幾下,，但鏡下組織就變得亂七八糟的了（別問(wèn)我是怎么知道的） 

4、PBS 在洗的時(shí)候,，不要對(duì)著組織沖洗,，會(huì)脫片。小編的方法是將沖洗著力點(diǎn)放在玻片的邊緣,，讓液體自然流向組織,。 

5,、一抗?jié)舛戎陵P(guān)重要，這直接影響了最終的結(jié)果,，摸條件時(shí)設(shè)置一抗?jié)舛忍荻?。建議同時(shí)設(shè)置一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，可以排除一抗之外的操作問(wèn)題,。 

6,、背景染色過(guò)深的話，就要考慮一抗?jié)舛冗^(guò)高或者一抗時(shí)間過(guò)長(zhǎng),，顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)這些問(wèn)題了,。

7、降低組織非特異性染色,，可以縮短一抗,，二抗的時(shí)間，稀釋抗體,，也可以增加幾次 PBS 沖洗,。或者直接用單抗,。

免疫組化往往作為檢測(cè)某蛋白在組織的表達(dá)情況出現(xiàn)在預(yù)實(shí)驗(yàn)中,，免疫組化的結(jié)果可能將直接影響課題的后續(xù)設(shè)計(jì)和進(jìn)展。如果說(shuō)我們的科研課題是一個(gè)大世界的話,，免疫組化是我們看向這個(gè)世界的敲門(mén)磚,。做好免疫組化，我們一起去更大的世界看看,！