正規(guī)化管理的實驗室都會給新人進行相關技能體系的培訓,，但是被老板散養(yǎng)的研究僧或者無奈從 0 開始做科研的臨床醫(yī)生也不在少數(shù)。他們在初始接觸分子實驗時，手持《現(xiàn)代分子生物學實驗指導》這本寶典,，很容易被五花繚亂的實驗方法亂了陣腳······

連轉錄和反轉錄都不太搞得清楚的科研新人如何根據(jù)自己的實際情況各取所需呢？首先,，明確自己的定位,，你目前要解決的是單個問題而不是一口吃成一個大胖子，然后關鍵是明確實驗對象和實驗目的,。 

舉個栗子,，現(xiàn)在手頭上的樣本是某個類型腫瘤臨床患者切除的組織，目的是檢測這些樣本與正常組織樣本中幾個“明星分子（如 P53 等與癌癥密切相關的分子）"是不是有差異表達,，該怎么做,？

1.明確自己最后一步實驗是什么 

根據(jù)實驗目的，最后一步的實驗其實已經(jīng)確定了,，就是從分子層面比較不同樣本中幾個基因的表達,，但是分子層面可以是 RNA 轉錄水平，也可以是蛋白質表達水平,。作為新人,，自然選擇前者，因為經(jīng)打聽和查資料后我發(fā)現(xiàn),，RNA 轉錄使用實時熒光定量 PCR（qPCR）方法就好,，容易上手出結果快，而對比蛋白質表達水平的 Western Blot（WB），在抗體成本和摸索實驗體系的時間成本上都不合算（當然,，很多實驗中如果 RNA 轉錄水平出現(xiàn)差異,，還是很有必要在蛋白水平進行驗證的）。 

所謂 qPCR 技術,，是指在 PCR 反應體系中加入熒光基團,，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個 PCR 進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法,。該技術實現(xiàn)了 PCR 從定性到定量的飛躍,，它以其特異性強、靈敏度高,、重復性好,、定量準確、速度快,、全封閉反應等優(yōu)點成為了分子生物學研究中的重要工具,。

2.找出所有涉及到的分子實驗 

從最后一步實驗往前推，qPCR 需要哪些基本的元素,？具體如下： 

*qPCR 的模板→當然不能直接用腫瘤組織和正常組織→查資料發(fā)現(xiàn)模板是 cDNA→怎么制備 cDNA,？→提取所有組織樣本的 RNA 進行反轉錄（逆轉錄-聚合酶鏈式反應，RT-PCR）→我需要 RNA 抽提試劑盒和反轉錄試劑盒→完成 RNA 的提取和 cDNA 的合成（放心,，試劑盒里都會有非常具體的操作說明書,，但是自己要多查資料了解原理，不然你和流水線操作員何異,？） 

*qPCR 的引物→根據(jù)已經(jīng)確定的分子自己使用引物設計軟件設計或者查找文獻找到經(jīng)過驗證的引物,，不要忘了 GAPDH 或者其他內參的引物 

*SYBR® GREEN→商業(yè)試劑盒 

*酶→包含在 SYBR® GREEN 試劑盒中 

*RNase-free H2O→一般在 SYBR® GREEN 中會有對應的 H2O，小伙伴們千萬不要使用正常 PCR 中使用的高溫滅菌 H2O,，否則溶解曲線讓你分分鐘想撞墻,。

3.Just do it 

根據(jù) SYBR® GREEN 試劑盒說明書中的體系要求完成實驗操作（冰上操作）和對 qPCR 儀器的設置，具體儀器的使用方法一定要多多問別人,。