DNA 測序技術(shù)自從發(fā)明以來，作為一種重要的分子生物學(xué)手段,，正在科研和臨床上得到了越來越廣泛的應(yīng)用,。下面，介紹一下DNA測序里的大坑,。給大家一個前車之鑒吧,。

坑一：信號衰減/中斷

測序信號衰減和中斷，是測序過程中的常見問題,，原因多種多樣：模板中含有重復(fù)序列,，模板中含有高級結(jié)構(gòu)，模板中 GC 含量過高等,，都會使得測序信號衰減和中斷,。另外，引物的質(zhì)量不好,，試劑失活了,，都會造成這種問題。解決的方法：反其道而行之,，采用反向引物來進(jìn)行測序,，然后通過序列拼接獲得全長。有時候就象做拼圖游戲,。大家 have fun 吧,。這里，教大家一個小竅門：在這個過程中,，可以適量地加入 DMSO,，并且進(jìn)行擴(kuò)增。

坑二：重疊峰/亂峰

這個問題一般是由于序列前面有連續(xù)的堿基,，或者是引物的堿基缺失了,。如下圖所示，模板中有單一位點(diǎn)的堿基缺失,，堿基缺失導(dǎo)致測序結(jié)果移碼,。

現(xiàn)在有很多測序公司，號稱可以幫助設(shè)計引物,；號稱引物是 PAGE 級別的,。這里，嚴(yán)重不推薦哈,。最好還是自己動手,，豐衣足食。解決辦法：自己設(shè)計引物,；自己合成引物,；自己將引物進(jìn)行 PAGE 純化。反正就是掌握一個原則：自己動手,，豐衣足食,。

坑三：Ploy 結(jié)構(gòu)

有的時候，我們會遇到 Poly 結(jié)構(gòu),，就是 G/C rich,，G/C Cluster，Poly A,，Poly T 結(jié)構(gòu)等,。這種結(jié)構(gòu)的測序容易出現(xiàn)移碼現(xiàn)象，導(dǎo)致測序信號衰減和中斷（如下圖）,。解決方法：還是反其道而行之,。采用反向引物對模板進(jìn)行測序，測到該 poly 結(jié)構(gòu)處,，進(jìn)行拼接,，不就可以獲得序列全長嘛。

坑四：空載體

原因?yàn)椋耗康钠尾迦胧?，或者培養(yǎng)過程中目的片段丟失。解決方案：重起爐灶,。重新挑選單克隆,，進(jìn)行 PCR 后，再送去測序,。

坑五：測序結(jié)果和文獻(xiàn)資料不一樣

這個會以為是實(shí)驗(yàn)?zāi)睦锍鰡栴}了,，或者是測序公司那里出問題了。這個問題是沒有辦法滴,。同一種動物,，不同的種族，甚至不同的個體,，基因序列都不一定*一樣,。如果是 PCR 產(chǎn)物克隆測序，那還有 PCR 過程中的錯配因素等等,。

一般比較正規(guī)的測序公司,，提供的測序結(jié)果都是忠實(shí)結(jié)果，和文獻(xiàn)序列不一樣,，也就只好不一樣啦,。

坑六：重復(fù)序列

如下圖所示，好看吧,？好看是好看,，但是真的看到這個結(jié)果，可能就要哭鼻子了,?？赡艿脑颍簶悠分芯秃兄貜?fù)序列，結(jié)果導(dǎo)致：測序結(jié)果和 Poly A/T 的結(jié)果一樣,。這也會導(dǎo)致 Frame 滑動,，結(jié)果出現(xiàn)移碼。

解決辦法: 還是反其道而行之,，反向測序。有時能夠順利的通過重復(fù)序列區(qū)域,，但是有時候又不一定能夠,。全靠運(yùn)氣吧。如果能夠的話,，通過多次的測序結(jié)果比對,，還是做拼圖游戲吧，拼接可以得到全序列結(jié)果,。