DNA 測序技術(shù)自從發(fā)明以來,，作為一種重要的分子生物學(xué)手段，正在科研和臨床上得到了越來越廣泛的應(yīng)用,。下面,，介紹一下DNA測序里的大坑。給大家一個前車之鑒吧,。

坑一：信號衰減/中斷

測序信號衰減和中斷,，是測序過程中的常見問題，原因多種多樣：模板中含有重復(fù)序列,，模板中含有高級結(jié)構(gòu),，模板中 GC 含量過高等，都會使得測序信號衰減和中斷,。另外,，引物的質(zhì)量不好，試劑失活了,，都會造成這種問題,。解決的方法：反其道而行之，采用反向引物來進行測序,，然后通過序列拼接獲得全長,。有時候就象做拼圖游戲。大家 have fun 吧,。這里,，教大家一個小竅門：在這個過程中，可以適量地加入 DMSO,，并且進行擴增,。

坑二：重疊峰/亂峰

這個問題一般是由于序列前面有連續(xù)的堿基，或者是引物的堿基缺失了,。如下圖所示,，模板中有單一位點的堿基缺失，堿基缺失導(dǎo)致測序結(jié)果移碼,。

現(xiàn)在有很多測序公司，號稱可以幫助設(shè)計引物；號稱引物是 PAGE 級別的,。這里,，嚴重不推薦哈。最好還是自己動手,，豐衣足食,。解決辦法：自己設(shè)計引物；自己合成引物,；自己將引物進行 PAGE 純化,。反正就是掌握一個原則：自己動手，豐衣足食,。

坑三：Ploy 結(jié)構(gòu)

有的時候,，我們會遇到 Poly 結(jié)構(gòu)，就是 G/C rich,，G/C Cluster,，Poly A，Poly T 結(jié)構(gòu)等,。這種結(jié)構(gòu)的測序容易出現(xiàn)移碼現(xiàn)象,，導(dǎo)致測序信號衰減和中斷（如下圖）。解決方法：還是反其道而行之,。采用反向引物對模板進行測序,，測到該 poly 結(jié)構(gòu)處，進行拼接,，不就可以獲得序列全長嘛,。

坑四：空載體

原因為：目的片段插入失敗,，或者培養(yǎng)過程中目的片段丟失,。解決方案：重起爐灶,。重新挑選單克隆,，進行 PCR 后，再送去測序,。

坑五：測序結(jié)果和文獻資料不一樣

這個會以為是實驗?zāi)睦锍鰡栴}了,，或者是測序公司那里出問題了。這個問題是沒有辦法滴,。同一種動物,，不同的種族，甚至不同的個體，基因序列都不一定*一樣,。如果是 PCR 產(chǎn)物克隆測序,，那還有 PCR 過程中的錯配因素等等。

一般比較正規(guī)的測序公司,，提供的測序結(jié)果都是忠實結(jié)果,，和文獻序列不一樣，也就只好不一樣啦,。

坑六：重復(fù)序列

如下圖所示,，好看吧？好看是好看,，但是真的看到這個結(jié)果,，可能就要哭鼻子了?？赡艿脑颍簶悠分芯秃兄貜?fù)序列,，結(jié)果導(dǎo)致：測序結(jié)果和 Poly A/T 的結(jié)果一樣。這也會導(dǎo)致 Frame 滑動,，結(jié)果出現(xiàn)移碼,。

解決辦法: 還是反其道而行之,，反向測序,。有時能夠順利的通過重復(fù)序列區(qū)域，但是有時候又不一定能夠,。全靠運氣吧,。如果能夠的話，通過多次的測序結(jié)果比對,，還是做拼圖游戲吧,，拼接可以得到全序列結(jié)果。