之前談到了酶切切不動的問題。這一次,，我們探討一下酶切的另外一端：酶切切過頭的問題,。還是按照一貫的做法和思路，發(fā)現(xiàn)主要是兩個原因?qū)е碌?，解決辦法也是有的,。

一、酶切時間過長 

酶切時間過長的確有時候會對目的條帶有影響,，因為你用的酶可能會有星號活性,。那么什么叫星號活性呢？通俗一點講,，就是酶不去切它該切的地方,，瞎切一氣......酶切時間過長，會導致最后亂切,。安培建議：雙酶切不要超過 5 小時,。其實一般 3-4 小時足夠了,。你應該有提供給你酶的生物試劑公司的相應的說明書的吧？上面都有寫明酶的活性和作用時間?，F(xiàn)在的酶都很不錯的,，10 到 15 分鐘就可以都切完。一般只水浴一個小時,，不會再長了,。 如果時間太長，就會造成下圖所示的情況,。注意第四泳道紅框標注的地方。居然切出了 5 根 條帶,。這顯然是時間過長了,。

二、酶量過多 

和過長的反應時間會造成非特異性的酶切（星號活性）一樣,，酶加多了也會產(chǎn)生星號活性,。一般來說，所加酶的體積不能超過酶切總體積的 1/10,，否則甘油濃度會超過 5%,，會產(chǎn)生星號活力。在使用高酶量的時候需要注意甘油的最終濃度不要超過 5%,，也就是說 10ul 的體系,， 酶的用量不要超過 1ul。

以 TAKARA 的酶為例,，其對 1 單位酶的定義如下：在 50 μl 反應液中,，30℃溫度下反應 1 小 時，將 1 μg 的 λDNA *分解的酶量定義為 1 個活性單位(U),。 而該酶濃度約為 15 U/μl,。 在除外酶降解的因素外，理論上,，該酶可分解 15μg 的 DNA,。而一般從 1-4ml 菌液提出的 DNA 約為 3μg，而 PCR 純化后的產(chǎn)物（50 體系）約為 3μg,，所以即便全部加進去,，只要純化的質(zhì)量非常好，酶切也*切得動,。注意,，不要加多了呀。

但是給推薦的一般都是 20 ul 體系加 1ul,。 其實,，在 20ul 只加 0.5ul 酶,，切的效果也很好。

其實,，除了考慮酶濃度（每 ul 多少個單位）以外,，還應該考慮這種酶在 λ DNA 上的酶切位點數(shù)目。比如用 Hinc Ⅱ和 XbaI 雙切 pUC118,，這兩個酶在 pUC118 上都只有一個酶切位點,， 而在 λDNA 上的酶切位點分別是 35 個和 1 個。根據(jù)酶活性的定義,，相同單位的 Hinc Ⅱ和 XbaI 對 pUC118 的酶切效率是 35 比 1,，所以在雙酶切體系中，所用的 Hinc Ⅱ顯然應該要少很多,。舉這個例子,，是想說明：大家再考慮酶濃度的時候，應該多想一層,。

綜上所述,，酶切切過頭了的原因，其實并沒有酶切切不動那么復雜,。不外乎時間過長和酶量太大,。童鞋們只要注意一些，一般都沒有問題,。