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l 細胞鑒定

STR鑒定已通過

l 細胞來源

國家資源庫

l 細胞背景

該細胞穩(wěn)定表達SV40大T抗原，并且促進最適病毒產(chǎn)物的產(chǎn)生,。

l 細胞特性

1.來源：胚腎

2.形態(tài)：圓形,，貼壁生長+懸浮生長

3.含量：>1x106  細胞數(shù)

4.規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5.用途：僅供科研使用。

l 培養(yǎng)條件：

1）準備DMEM培養(yǎng)基,；優(yōu)質(zhì)胎牛血清,，10%；雙抗,，1%,。

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%,；二氧化碳,，5%。 溫度：37攝氏度,，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%,。

l 注意事項：

1. 細胞復(fù)蘇或傳代后會有少部分的細胞貼壁和部分懸浮的細胞，復(fù)蘇兩天后細胞會從貼壁細胞向外開始生長,，有時細胞再生長過程中,，細胞會再貼壁細胞的上方生長，形成不同的細胞層,，這種情況會有發(fā)生,。 在細胞復(fù)蘇的一周內(nèi)，培養(yǎng)瓶中 通常會有懸浮的活的細胞團,，在換液過程中不要丟棄在這些活的懸浮細胞,，可以通過離心（125×g）回收細胞，重新打回到培養(yǎng)瓶中,，分離或者丟棄漂浮的活細胞會使細胞數(shù)量變少,，引起細胞的停滯生長或細胞死亡。

2.培養(yǎng)條件的細微變化,，尤其是pH和培養(yǎng)基中血清的質(zhì)量,，可能會影響細胞的生長狀況,，在細胞的生長過程中會有細胞內(nèi)的液泡出現(xiàn)，特別在細胞快要融合是會出現(xiàn)這種情況,。培養(yǎng)細胞時使用未被滅活的高質(zhì)量,、低內(nèi)毒素的胎牛血清，可以使細胞更好的貼壁和形成單層細胞,。

3. 細胞在生長過程中可以通過將血清濃度提到到20%來改善細胞生長緩慢的情況,。（參考atcc 有關(guān)該細胞的描述）

l 細胞培養(yǎng)：

1）凍存細胞的復(fù)蘇：

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL*培養(yǎng)基的離心管中混合均勻,。在1000RPM條件下離心3-5min,，棄去上清液，*培養(yǎng)基重懸細胞,。然后將細胞懸液加入含6-8ml*培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜,。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達70%-90%,，即可進行傳代培養(yǎng),。

該細胞為輕微貼壁和少量懸浮培養(yǎng)細胞，傳代可以參考以下方法：

1. 收集：將培養(yǎng)瓶中的懸浮的細胞收集到離心管中,。用不含鈣,、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。由于細胞貼壁不牢PBS潤洗后細胞會脫落所以PBS也要回收到離心管中,。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL,，T75瓶2-3mL）置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,，若細胞大部分變圓并脫落迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。

3. 將收集到的懸浮細胞,、pbs清洗液中的細胞和消化下來的貼壁細胞以1000rpml離心5min,，棄去上清，補加1-2mL培養(yǎng)液后重懸混勻后將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中,，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的*培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力,，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進行,。

3） 細胞凍存: 收到細胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細胞種子以備后續(xù)實驗使用,。下面T25瓶為例；

1.細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中,，可使用血球計數(shù)板計數(shù),，來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個活細胞/ml.

2.1000rpm離心3-5min,，去掉上清,。用配制好的細胞凍存液重懸細胞 ,，按每1ml凍存液含1×106~1×107個活細胞/ml分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中，標注好名稱,、代數(shù),、日期等信息。

3.將要凍存的細胞置于程序降溫盒中,，-80度冰箱中過夜,，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用,。

l 運輸形式：

低溫：（1）1mL凍存管包裝干冰運輸,，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈,、凍存管瓶蓋脫落,、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系,。

常溫（2） T25瓶復(fù)蘇的存活細胞常溫發(fā)貨,，收到后按照細胞接收后的處理方法操作。

l 生物安全

1. 所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性,，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作,，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄,。

2. 建議在復(fù)蘇凍存細胞時始終使用防護手套,、衣服和戴上防護面罩。注意：凍存管浸沒在液氮中會泄漏,，并會慢慢充滿液氮,。解凍時，液氮轉(zhuǎn)化成氣相可能導(dǎo)致容器爆炸或用危險力吹掉其蓋子,，從而產(chǎn)生飛揚的碎屑造成人員傷害,。