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肉毒梭菌毒素酶聯(lián)免疫分析（ELISA）
肉毒梭菌毒素酶聯(lián)免疫分析（ELISA） 試劑盒使用說明書 本試劑盒僅供研究使用,。 1 使用目的： 本試劑盒用于肉類組織（如雞、牛肉和豬肉）,，血清和尿樣中肉毒梭菌毒素殘留的定量 檢測,。 2 實驗原理 本試劑盒采用競爭 ELISA 方法，在微孔板包被有肉毒梭菌毒素偶聯(lián)抗原,，加入肉毒梭 菌毒素標準品或樣品,，游離肉毒梭菌毒素與微孔條上預(yù)包被的肉毒梭菌毒素偶聯(lián)抗原互相競 爭抗肉毒梭菌毒素抗體酶標記物，用 TMB 底物顯色,，加入終止液后顏色由藍色變?yōu)辄S色,， 用酶標儀在 450nm 波長下進行檢測,，吸光值與樣品中肉毒梭菌毒素含量成反比，通過標準 曲線計算樣品中肉毒梭菌毒素的含量,。 3 試劑盒組成 3.1 預(yù)包被的肉毒梭菌毒素偶聯(lián)抗原的可拆酶標板：1 塊（12 孔×8 條）,。 3.2 肉毒梭菌毒素標準品：6 瓶（1ml/瓶），含量分別是： 0 ppb,，0.1 ppb,0.3 ppb,0.9 ppb,2.7 ppb,8.1 ppb,。 3.3 抗肉毒梭菌毒素抗體酶結(jié)合物：1 瓶（6ml）。 3.4 顯色液 A：1 瓶（6ml）,。 3.5 顯色液 B：1 瓶（6ml）,。 3.6 終止液：1 瓶（6ml），2M 硫酸,。 3.7 樣本稀釋液：1 瓶（10×, 6ml）,，用于樣品稀釋用。 3.8 濃縮洗滌液：1 瓶（20×,，20ml），用于洗板,。 3.9 說明書一份,。 4 需要而未提供的材料 4.1 設(shè)備 4.1.1波長450nm酶標儀。 4.1.2粉碎機,。 4.1.3量筒,。 4.1.4振蕩器。 4.1.5漏斗,。 4.1.6Whatman No 1或相當?shù)臑V紙,。 4.1.7微量移液器。 4.2 試劑 4.2.1去離子水或蒸餾水,。 4.2.2 甲醇,。 5 貯存 5.1 試劑盒貯存于2~8℃，切勿冷凍 5.2 未用完的微孔板應(yīng)該密封干燥保存 6 注意事項 6.1 使用試劑盒前請仔細閱讀說明書,。2 6.2 不要使用過期試劑盒,。 6.3 試劑盒使用前，將試劑恢復(fù)至室溫（25±2℃）,，建議至少回溫2小時,。 6.4 標準品中含有肉毒梭菌毒素，使用時應(yīng)特別注意,，操作時應(yīng)帶手套,。 6.5 終止液中含有硫酸，使用時防止灼傷皮膚及腐蝕衣物,。 6.6 不同標準品,、樣品所用吸頭不能混用,，否則會影響試驗結(jié)果。 6.7 不同批號試劑盒中的試劑不得混用,；不同標準品,、樣品所用吸頭不得混用，否則會影響 實驗結(jié)果,。 6.8 稀釋樣本時必須用本試劑盒中的樣本稀釋液,，否則會影響實驗結(jié)果 6.9 混合試劑時應(yīng)避免起泡。 7 工作液準備 7.1 肉毒梭菌毒素標準品溶液：0ppb,0.1ppb,0.3 ppb,0.9ppb,2.7 ppb,8.1ppb 7.2 濃縮洗滌液：用蒸餾水按1:20(1+19)稀釋備用 7.3 樣本稀釋液：用蒸餾水按1:10(1+9)稀釋備用 7.3 顯色劑：已備用,，避免光線直照 7.4 反應(yīng)終止液：已備用 8 樣品處理程序（樣品在提取過程中,，要嚴格按說明書操作，提取過程中應(yīng)準確稀釋,，否則 會出現(xiàn)結(jié)果不準確,，樣品應(yīng)當保存在陰涼避光之處及冷藏保存） 8.1取10g粉碎的樣品，加 20ml 70%甲醇溶液 8.2強力振蕩3分鐘 8.3用Whatman No 1濾紙過濾 8.4取25µl處理后的樣品,，加入25µl樣本稀釋液于反應(yīng)孔中（樣本稀釋倍數(shù)為2） 9 酶免分析步驟 9.1 實驗須知 9.1.1 實驗開始前請將所有試劑于盒外充分恢復(fù)至室溫（25±2℃）,，時間約2小時?；販刂潦?溫（25±2℃）后再取出微孔條,，多余的微孔條重新密封立即于2~8℃干燥保存 注：一定保證回溫充分，否則影響檢測的精確度和準確度,。 9.1.2 使用后請立即將試劑放回2~8℃保存 9.1.3 請不要改變分析程序 9.1.4 請使用精確的微量移液器 9.1.5 操作一旦開始,，請不要中斷任何程序 9.1.6 ELISA結(jié)果的可重復(fù)性極大程度的取決于操作程序，請嚴格按照要求操作 9.1.7 為避免交叉污染,，每個標準品和樣品均應(yīng)使用不同的吸頭加樣 9.1.8 加樣時請勿讓吸頭接觸微孔中的溶液或內(nèi)表面 9.2 分析步驟 9.2.1 預(yù)*行編號,，標記B0、標準品和樣品的位置,，推薦進行雙孔檢測 9.2.2 取所需數(shù)量的微孔（微孔條可拆）,，將多余板條重新密封并立即放回2~8℃保存 9.2.3 樣品稀釋液（10×）、濃縮洗滌液（20×）稀釋成工作液(蒸餾水或去離子水稀釋) 9.2.4 在B0孔中加入50µl 0.0ppb標準品溶液 9.2.5 在各標準孔中加入50μl的標準品溶液 9.2.6 在各樣品孔中加入50µl樣品溶液 9.2.7 在所有孔中加入50µl的抗肉毒梭菌毒素抗體酶結(jié)合物 9.2.8 輕輕晃動反應(yīng)板幾秒鐘,。 9.3 37℃溫浴30min （溫浴過程中不時輕拍反應(yīng)板,，可以減少雙孔誤差） 9.3.1 甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板5次,，最后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以*除去孔中液3 體,。9.4 反應(yīng) 9.4.1 洗滌程序完成后，立即用微量移液器在每個微孔中先加入50µl顯色液A,，再加 50µl顯 色液B,；輕微晃動反應(yīng)板使之*混勻 9.4.2 37℃溫浴10min 9.4.3 每孔中加入50µl終止液，混勻 9.4.4 在450nm下檢測吸光度，結(jié)果在5min內(nèi)讀取,。 10 結(jié)果計算 10.1定量分析 10.1.1所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個標準（0標準） 的吸光度值（B0）再乘以100%,，即百分吸光度值。 B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B0—0µg/L標準溶液的平均吸光度值 10.1.2以肉毒梭菌毒素濃度的對數(shù)值為X軸,，百分吸光度值為Y軸,，繪制標準曲線圖。根據(jù)樣 品百分吸光度值,，可從曲線上得到對應(yīng)點的橫坐標,，即為肉毒梭菌毒素濃度的對數(shù)值，求得 反對數(shù)即為測定液中肉毒梭菌毒素濃度C（ppb） 10.1.3由于樣品經(jīng)過了預(yù)先稀釋,，因此根據(jù)標準曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋 倍數(shù),。 10.2 半定量測定 10.1.1目測半定量測定：首先選擇一個適當?shù)臉藴室号c樣品同運行，根據(jù)樣品與標準品顏色 深淺比較,，判斷樣品濃度值是小于還是大于標準值,。 10.1.2儀器半定量測定：首先選擇一個適當?shù)臉藴室号c樣品同運行，根據(jù)樣品與標準品吸光 度值的高低比較,，判斷樣品濃度值是小于還是大于標準值,。 11 特異性 物質(zhì) 交叉反應(yīng) 肉毒梭菌毒素 100% 12 試劑盒參數(shù) 本試劑盒檢測下限為0.05ppb B0吸光度最佳值應(yīng)大于1.0 試劑盒吸光度板內(nèi)誤差小于8％，板間誤差小于15％,。 用本說明書提供的組織樣本提取方法回收率大于80％,。 13試劑盒提供的標準曲線范圍為0.1ppb~8.1ppb。 14 分析限制 本試劑盒檢測為陽性的樣品應(yīng)該用另一種方法如HPLC或GC/MS加以確證,。