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血液冷凍干燥機(jī)
目前國(guó)內(nèi)血小板主要保存方式是22℃振蕩保存,，有效期為 5d,。 此外血小板還可深低溫冰凍保存， 但這種方法的保存效果和臨床療效不確切,。 近年冷凍干燥技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各種生物材料的保存， 凍干制品具有常溫下保存,、 性能穩(wěn)定,、便于運(yùn)輸?shù)奶攸c(diǎn)。 本研究以過(guò)期血小板為原料,，探索血小板凍干再水化的條件,，檢測(cè)其凍干再水化后凝血功能的變化， 為過(guò)期血小板再利用及新鮮血小板冰凍或低溫保存研究提供了依據(jù),。
駿德儀器實(shí)驗(yàn)型FD-503血液冷凍干燥機(jī)在市場(chǎng)上應(yīng)用而生,，成功助力各大科研單位，滿(mǎn)足了各個(gè)客戶(hù)的實(shí)驗(yàn)需求,。
凍干工藝介紹：
1,、 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1.1 血小板來(lái)源 實(shí)驗(yàn)組選擇體檢合格， 一周內(nèi)未服用**林等抗血小板藥物的自愿獻(xiàn)血者,，用血細(xì)胞分離機(jī)單采富含血小板血漿,，22℃振蕩保存 5d 過(guò)期；對(duì)照組選擇新鮮機(jī)采血小板,。
1.1.2 主要試劑和溶液 海藻糖 (CH22O11·2H2O,，北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司)； 牛血清白蛋白(BSA,，上海生工生物工程有限公司),；磷酸鹽緩沖液(PBS)； 血小板聚集誘導(dǎo)劑二磷酸腺苷(ADP,，Sigma公司),；**酶(Sigma 公司)；膠原(Sigma 公司),；瑞斯托霉素(Sigma 公司),；CD62P-PE(Bioscience 公司)；PAC-1-FITC(BDIS 公司 ),； 海藻糖加載緩沖液 ( 含50mmol/L 海藻糖,，100mmol/L NaCl，10mmol/L KCl,，10mmol/L EGTA,，pH 為 6.8),；凍干保護(hù)劑(含 20%海藻糖 ，1% 牛血清白蛋白 ,，9.5mmol/L HEPES,，142.5mmol/L NaCl，4.8mmol/L KCl,，1mmol/L Mg-Cl2),；復(fù)水溶液為 PBS 緩沖液和蒸餾水以 3:1 比例混合制成。 以上試劑和溶液均在有效期內(nèi),。
1.2 主要儀器
駿德儀器實(shí)驗(yàn)型FD-503血液冷凍干燥機(jī)（濟(jì)南駿德儀器有限公司）,、恒溫振蕩水浴、流式細(xì)胞儀等
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 血小板的凍干保存 血小板濃縮液離心洗滌后重懸于海藻糖加載緩沖液中,， 將上述懸浮液轉(zhuǎn)移進(jìn)入離心管中,，并用聚四氟乙稀生料帶密封，于37℃水浴中振蕩孵化 4h,。 將孵化后的血小板懸浮液 800g 離心 3min,。 去除上層孵化液，得到沉淀的血小板塊,，加入凍干保護(hù)液打散重懸,，使用血球**進(jìn)行計(jì)數(shù)， 調(diào)節(jié)血小板在凍干保護(hù)液中的濃度為 1×109個(gè)/ml,。 將制備好的血小板凍干懸浮液裝入特制凍干血盒中,，密封充注口。 將血小板凍干懸液先以 20℃/min 的速率凍結(jié)至-40℃,， 預(yù)凍 2h后,，再以 1.5℃/min 對(duì)擱板升溫至-30℃,，退火 0.5h,，然后進(jìn)入一次干燥,，-38℃維持一次干燥條件 20h,，zui后以 0.2℃/min 的加熱速率使隔板溫度升高至20℃,，維持二次干燥條件 10h 直至凍干結(jié)束,。 凍干的血小板密封保存在室溫,。
1.3.2 凍干血小板的水化 將 PBS 緩沖液和蒸餾水以 3:1 的比例混合制成血小板凍干復(fù)水液,，將1ml 復(fù)水液在室溫下直接加入凍干樣品瓶中,，輕輕震蕩直到樣品*溶解于復(fù)水溶液中。
1.3.3 檢測(cè)血小板回收率 用血球**分別對(duì)凍干前和凍干再水化后的血小板計(jì)數(shù),， 計(jì)算凍干再水化血小板回收率,。凍干再水化血小板回收率(%)=凍干再水化后血小板計(jì)數(shù)/凍干前血小板計(jì)數(shù)×100%。
1.3.4 檢測(cè)血小板穩(wěn)定性 凍干再水化血小板分別在室溫放置 0h,、2h,、4h,、6h、8h 后,，用血球**測(cè)定血小板回收率。
1.3.5 血小板形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)觀察 用掃描電鏡觀察血小板的形態(tài)；分別以戊二醛固定,、脫水,、環(huán)氧樹(shù)脂包埋后制作超薄切片,， 用透射電鏡觀察血小板超微結(jié)構(gòu)變化。
1.3.6 血小板聚集反應(yīng)檢測(cè) 將凍干血小板復(fù)水后轉(zhuǎn)入離心管中進(jìn)行洗滌以去除細(xì)胞外保護(hù)劑,，再用新鮮冰凍血漿重懸血小板,， 調(diào)整血小板濃度為(0.2~0.3)×1012/L。 用 APACT-2 型血小板**凍干再水化后血小板對(duì)四種同濃度誘導(dǎo)劑—凝血酶,、膠原,、ADP 和瑞斯托霉素的聚集反應(yīng)。
1.3.7 血小板表面糖蛋白檢測(cè) 用三色流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)凍干再水化血小板表面激活指標(biāo) CD62p和 PAC-1 的表達(dá),，經(jīng)凝血酶激活后測(cè)定 CD62p 和PAC-1 的再表達(dá),。 再表達(dá)率=凝血酶處理后表達(dá)率-血小板表達(dá)率1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,，采用 SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理， 組間差異比較用 t 檢驗(yàn),，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,。
2、 結(jié)果
2.1 血小板回收率及穩(wěn)定性 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間血小板計(jì)數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),，凍干再水化血小板回收率為 49.36%,，見(jiàn)表 1；凍干再水化血小板穩(wěn)定性隨血小板放置時(shí)間的延長(zhǎng),， 血小板回收率逐漸下降,，見(jiàn)圖 1。
2.2 血小板形態(tài)及超微結(jié)構(gòu) 掃描電鏡顯示新鮮血小板透光性較強(qiáng),，形態(tài)呈圓形或橢圓形,，邊緣光滑， 而凍干再水化血小板透光性較弱,， 血小板變形,，見(jiàn)圖 2A 和 B。 透射電鏡顯示新鮮血小板著色較深,，α 顆粒,、致密顆粒,、過(guò)氧化酶顆粒等分散,、清晰,，而凍干再水化血小板著色較淺，致密顆粒及 α顆粒不夠清晰，且數(shù)目少于對(duì)照組，見(jiàn)圖 2C 和 D。
2.3 聚集反應(yīng) 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間血小板同濃度誘導(dǎo)劑下的zui大聚集率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組血小板對(duì)凝血酶,、膠原,、ADP 和瑞斯托霉素的聚集功能較對(duì)照組均出現(xiàn)下降,，見(jiàn)表 2。
2.4 血小板表面糖蛋白 實(shí)驗(yàn)組 CD62p 表達(dá)率和再表達(dá)率分別為 50.25%,、94.27%,，均顯著高于對(duì)照組的 8.12%、78.43%(P<0.05),；凝血酶作用后 CD62p再表達(dá)率為 44.02%,，顯著低于對(duì)照組 70.31% (P<0.05)。 pac-1="" p="">0.05),，PAC-1 再表達(dá)率為42.75%,，顯著低于對(duì)照組 67.29%(P<0.05)，凝血酶作用后 PAC-1 再表達(dá)率為 38.90%,，顯著低于對(duì)照組 65.28%(P<0.05),，見(jiàn)表 3。
3,、討論
血小板數(shù)目減少或功能不全所致出血性疾患的預(yù)防和治療,，臨床多采用輸注血小板制劑。 血小板保存技術(shù)的缺陷是血小板過(guò)期浪費(fèi)和臨床供不應(yīng)求的兩難處境的主要原因,，因此,，研究出一種能長(zhǎng)期、,、安全和方便的血小板保存方法一直是國(guó)內(nèi)外輸血工作者關(guān)注的熱點(diǎn)和難題,。
將過(guò)期的血小板再利用及血小板的凍干保存有著廣闊的應(yīng)用前景。 本研究顯示凍干再水化的過(guò)期血小板回收率及穩(wěn)定性較差,， 說(shuō)明凍干和再水化過(guò)程對(duì)血小板功能造成一定影響,， 應(yīng)進(jìn)一步改進(jìn)凍干保存時(shí)擱板溫度，復(fù)水液組分和比例,，以及增加預(yù)復(fù)水步驟,。 透射電鏡下新鮮血小板著色相對(duì)較深， 可能為新鮮血小板生物活性較高或膜通透性相對(duì)較高,，因而有較強(qiáng)吸附染料的能力,。
CD62p 和 PAC-1 分別為血小板表面活化晚期標(biāo)志物和活化早期的標(biāo)志物， 結(jié)果顯示過(guò)期血小板對(duì)凝血酶,、ADP,、 膠原及瑞斯托霉素的zui大聚集率明顯小于新鮮血小板，凝血酶作用后 CD62p 和 PAC-1 的再表達(dá)率低于新鮮血小板,，說(shuō)明過(guò)期以及凍干和再水化過(guò)程對(duì)血小板凝血功能有影響,， 但凍干再水化的過(guò)期血小板仍具有一定的存活能力和功能活性,， 因此選擇血小板進(jìn)行冷凍干燥保存是血小板長(zhǎng)期保存切實(shí)可行的方法， 為新鮮血小板冷凍干燥保存提供理論依據(jù),。 但對(duì)該方法保存血小板的回收率,、 穩(wěn)定性以及凝血功能等還需做進(jìn)一步研究與改進(jìn)，以達(dá)到臨床應(yīng)用的要求,。
