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本視頻為普諾賽貼壁細(xì)胞凍存操作指南,，對每一步操作都做了演示,，以便實(shí)驗(yàn)者更好地理解貼壁細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn)過程,。

貼壁細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：
將15mL離心管,、凍存管,、PBS緩沖液,、移液管,、電動(dòng)移液器等物品提前放入生物安全柜中，紫外照射30min消毒滅菌,；
細(xì)胞*培養(yǎng)基,、0.25%胰酶-0.02%EDTA、細(xì)胞凍存液等從4℃冰箱中取出后,，復(fù)溫至室溫,，備用；程序降溫盒復(fù)溫至室溫備用,。

貼壁細(xì)胞凍存操作步驟：
1. 從培養(yǎng)箱中取出準(zhǔn)備凍存的細(xì)胞,；
2. 顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)并拍照記錄；
3. 酒精消毒培養(yǎng)瓶后放入安全柜中,；
4. 吸去多余的培養(yǎng)基,，加人2~3ml PBS緩沖液潤洗一次；
5. 加入1ml胰酶,，放入37℃消化,；
6. 消化1min左右，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,；  
7. 消化*后,，加3ml*培養(yǎng)基終止；
8. 將細(xì)胞懸液移入15ml離心管中離心,，1000rpm/min（約200g）離心3-5min,；
9. 吸去多余的液體,，向細(xì)胞沉淀中加入適量的凍存液，輕輕吸打混勻,；
10. 按比例分裝至凍存管中,；
11. 貼好標(biāo)簽后放入梯度凍存盒中；
12. 將凍存盒放入-80℃,，降溫過夜后,，移入液氮中保存。

注意事項(xiàng)：
1）細(xì)胞凍存液需提前配制,，不可直接將DMSO加入細(xì)胞懸液中,；
2）不同細(xì)胞消化時(shí)間有差異，以實(shí)際鏡檢結(jié)果為準(zhǔn),，大部分細(xì)胞回縮變圓并有少量細(xì)胞脫落即可中止消化,，消化時(shí)間不宜過長；
3）應(yīng)選擇匯合度80%-90%左右,，細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行凍存操作,，確保細(xì)胞凍存時(shí)狀態(tài)最佳，凍存密度可根據(jù)細(xì)胞特性進(jìn)行調(diào)整,；
4）凍存細(xì)胞保存溫度應(yīng)低于-130℃,，不可在-80℃長期保存。