外泌體（Exosomes）是一類直徑約30-150 nm的細(xì)胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）,，可由多種類型細(xì)胞在正常及病理狀態(tài)下分泌,，廣泛參與細(xì)胞間通訊，并在腫瘤微環(huán)境調(diào)控,、免疫調(diào)節(jié),、神經(jīng)退行性疾病等多個(gè)研究領(lǐng)域展現(xiàn)出重要價(jià)值[1]。隨著外泌體研究的深入,，如何高效可靠地分離外泌體成為科研人員關(guān)注的焦點(diǎn),。不同的分離方法在純度、回收率,、操作便捷性等方面各有千秋,，研究者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需求選擇最合適的分離方法。
本期細(xì)胞學(xué)堂將全面介紹外泌體分離的五個(gè)主要方法,，并深入探討如何選擇合適的方法分離外泌體,，助您順利展開(kāi)實(shí)驗(yàn)。
如何選擇合適的外泌體分離方法
外泌體分離主要方法詳解
超速離心法
（Ultracentrifugation, UC）
原理
超速離心法是根據(jù)樣品中外泌體與其他成分在尺寸和密度上的差異，通過(guò)一系列不同離心力和離心時(shí)間的超速離心步驟,，逐步去除非外泌體成分，最終將外泌體沉淀并重新懸浮,。
圖1 超速離心流程示意圖[2]
優(yōu)點(diǎn)
1
去除了大部分污染物,，分離得到的外泌體較純凈
2
適用于大體積樣本（如細(xì)胞培養(yǎng)上清,、血清等）
3
無(wú)需額外試劑，避免了化學(xué)試劑的污染
缺點(diǎn)
1
需要超速離心機(jī),，設(shè)備昂貴,，操作復(fù)雜
2
高離心力可能導(dǎo)致外泌體結(jié)構(gòu)損傷,，影響其完整性
3
回收率較低,，部分外泌體可能無(wú)法有效沉淀
密度梯度離心法
（Density Gradient Centrifugation, DGC）
原理
密度梯度離心法是一種基于外泌體與其他細(xì)胞成分密度差異的精細(xì)分離技術(shù),。通常使用蔗糖或碘克沙醇（Iodixanol）作為密度梯度介質(zhì)，并通過(guò)超速離心來(lái)實(shí)現(xiàn),。外泌體會(huì)根據(jù)自身浮力密度（1.13–1.19 g/mL）在特定界面富集,。
分離步驟
1
樣品預(yù)處理：離心去除細(xì)胞碎片和大顆粒雜質(zhì)；
2
密度梯度制備：通過(guò)逐漸混合不同密度的蔗糖或碘克沙醇溶液,，形成一個(gè)從低密度到高密度的連續(xù)密度梯度,；
3
樣品加載與超速離心：將外泌體粗提物（PBS重懸后）緩慢鋪于密度梯度頂部，以100,000–120,000 ×g,，16-18 h,，4℃進(jìn)行超速離心；
4
外泌體收集：使用移液器或取樣管在1.13-1.19 g/mL密度范圍內(nèi)回收富集的外泌體層,；
5
介質(zhì)去除與重懸：將收集到的外泌體用PBS稀釋后再次進(jìn)行100,000 ×g,，70 min離心，去除梯度介質(zhì)并重懸外泌體,。
優(yōu)點(diǎn)
1
外泌體純度高,，可去除蛋白、脂質(zhì)等污染物
2
適用于對(duì)外泌體功能研究要求較高的實(shí)驗(yàn)
缺點(diǎn)
1
操作繁瑣,，需要長(zhǎng)時(shí)間（≥16 h）離心
2
樣本處理量小,，不適合大規(guī)模樣本分離
尺寸排阻色譜法
（Size-Exclusion Chromatography, SEC）
原理
利用多孔球狀填料形成色譜柱,，樣本流經(jīng)色譜柱時(shí)，不同尺寸的分子以不同速率流出,。外泌體（30-150 nm）介于大蛋白與細(xì)胞外囊泡之間,，可在特定洗脫體積內(nèi)被收集。
分離步驟
1
樣品預(yù)處理：去除大顆粒雜質(zhì),，并適當(dāng)濃縮樣品以提高分離效率,；
2
色譜柱準(zhǔn)備：裝填適合外泌體分離的填料，使用緩沖液平衡柱體,；
3
樣品上樣：緩慢加載樣品,，避免擾動(dòng)填料結(jié)構(gòu)；
4
洗脫與收集：按分級(jí)洗脫原則,，優(yōu)先收集外泌體富集部分,；
5
濃縮與純化（可選）：使用超濾或二次離心等方法提高外泌體純度。
優(yōu)點(diǎn)
1
溫和無(wú)損傷,，外泌體結(jié)構(gòu)保持完整
2
操作簡(jiǎn)便,，無(wú)需超速離心設(shè)備
3
分離效果較好，可去除蛋白污染
缺點(diǎn)
1
純度受限,，仍可能殘留其他細(xì)胞外囊泡
2
不適用于超大體積樣本
聚合物沉淀法
（Polymer Precipitation）
原理
利用聚合物（如聚乙二醇,，PEG）降低外泌體表面水合層的溶解度，使其在低速離心條件下沉淀,，從而從生物樣本中分離外泌體
分離步驟
1
樣品預(yù)處理：去除大顆粒雜質(zhì),，提高外泌體回收率；
2
添加聚合物溶液：充分混勻,，低溫孵育使外泌體沉淀,；
3
離心收集：低速離心獲取沉淀，去除上清,；
4
重懸與純化（可選）：使用緩沖液重懸,，可結(jié)合其他純化方法，如超濾,、密度梯度離心等以提高純度,。
優(yōu)點(diǎn)
1
操作簡(jiǎn)單，時(shí)間短（< 4 h）
2
無(wú)需昂貴設(shè)備,，適用于實(shí)驗(yàn)室常規(guī)分離
3
適合大體積樣本（血清,、尿液等）
缺點(diǎn)
1
可能存在聚合物殘留污染，影響下游實(shí)驗(yàn)（如蛋白分析）
2
共沉淀大量蛋白和其他顆粒,，外泌體純度較低
免疫親和分離法
（Immunoaffinity-Based Isolation）
原理
利用磁珠或親和樹(shù)脂為固相載體,，表面固定CD9、CD63,、CD81等外泌體特異性抗體,，特異性結(jié)合并分離外泌體,。
分離步驟
1
樣品預(yù)處理：去除大顆粒雜質(zhì)，提高分離效率,；
2
抗體結(jié)合：靶向外泌體表面標(biāo)志物的抗體與固相載體偶聯(lián),；
3
外泌體捕獲：將樣品與偶聯(lián)抗體孵育，使外泌體特異性結(jié)合,；
4
洗滌與洗脫：去除非特異性結(jié)合物,，釋放外泌體。
優(yōu)點(diǎn)
1
純度極-高,，可用于特定類型外泌體富集
2
適用于高靈敏度分析（如qPCR,、Western blot等）
缺點(diǎn)
1
試劑昂貴，適合小規(guī)模研究
2
易丟失部分外泌體,，回收率低
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參考文獻(xiàn)
[1]
Théry C, Zitvogel L, Amigorena S. Exosomes: composition, biogenesis and function [J]. Nature Reviews Immunology, 2002 Aug; 2(8):569-579.
[2]
Théry C, Amigorena S, Raposo G, et al. Isolation andcharacterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids [J]. Current Protocols in Cell Biolog, 2006 Apr; Chapter 3: Unit 3.22.
[3]
Contreras-Naranjo JC, Wu HJ, Ugaz VM. Microfluidics for exosome isolation and analysis: enabling liquid biopsy for personalized medicine [J]. Lab on a Chip, 2017 Oct 25; 17(21):3558-3577.
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