脾臟是機(jī)體重要的免疫器官之一,，含有大量的淋巴細(xì)胞，占全身淋巴組織總量的25%,，在小鼠中,，由于小鼠血液量少，從外周血液中分離大量淋巴細(xì)胞較為困難,，故經(jīng)常需要從其脾臟中獲取大量的淋巴細(xì)胞,。
不久前，來自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院的李老師在Biomaterials雜志上發(fā)布的文章中就用到了上述實(shí)驗(yàn),。以下為是李老師分享的一些相關(guān)經(jīng)驗(yàn),。
操作步驟
1 材料準(zhǔn)備
選取具有正常免疫功能的成年小鼠（所需的小鼠數(shù)量根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要決定，通常一只小鼠脾臟可提取的淋巴細(xì)胞數(shù)量為2~6×107）,，快速斷頸處死(避免脾梗死)后，浸泡于75%酒精中,；準(zhǔn)備好已消毒的眼科剪,、眼科鑷，以及一個(gè)裝有一定量PBS的無菌皿,，分離脾臟后置于皿中,，全程無菌操作；
2 小鼠脾臟處理
脾臟細(xì)胞數(shù)量較少時(shí),，可用兩個(gè)1mL無菌注射器的針尖將脾臟戳出大量的空洞后,，輕輕刮取脾臟表面，將脾臟細(xì)胞刮出,；數(shù)量較多時(shí),，可用細(xì)胞濾網(wǎng)進(jìn)行研磨后離心，也可得到淋巴細(xì)胞,。
3 離心
15mL離心管中吸入5mL ficoll分離液,，傾斜管身，小心吸取含淋巴細(xì)胞的PBS緩慢加入ficoll分離液，可見明顯液體分層,。600rpm梯度離心25分鐘,，升速/降速均為2；
4 二次離心
得到分為3層的液體, 小心吸取中間層液體（含淋巴細(xì)胞+紅細(xì)胞）并置于新的15mL離心管,，補(bǔ)滿PBS,，600rpm離心5分鐘；
5 三次離心
棄上清PBS, 可見黑紅色沉淀,，加入1~2mL紅細(xì)胞裂解液,，冰上裂解5分鐘，補(bǔ)滿PBS, 600rpm離心5分鐘,；
6 獲取淋巴細(xì)胞
棄上清PBS, 可見白色沉淀,，此為總淋巴細(xì)胞；計(jì)數(shù),；
7 重懸淋巴細(xì)胞
將提前過夜包被CD3抗體(包被濃度為5ug/mL)的96孔板中的PBS吸棄,，配制淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，1640全培+巰基乙醇+CD28抗體(終濃度2.5ug/mL),，重懸淋巴細(xì)胞并加入96孔板,，100~200ul/孔，通常淋巴細(xì)胞數(shù)量為1~3×105個(gè)/孔,。通常8個(gè)小時(shí)即可看到T細(xì)胞增殖團(tuán),，刺激48h后可以較好活化T淋巴細(xì)胞；
8 分選
若實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑榉诌xCD4/CD8 T淋巴細(xì)胞,，可以省去紅細(xì)胞裂解操作,，直接用磁珠抗體對淋巴細(xì)胞進(jìn)行避光孵育，并用PBS洗掉多余的試劑后,，棄上清,，用一定量PBS重懸淋巴細(xì)胞，緩慢加入預(yù)先潤濕過的macs tube(已安裝到磁力架上),。根據(jù)具體試劑和目的可以分為陰選和陽選：陰選需要從分選柱中流下的液體,，其中含有目的細(xì)胞；陽選則應(yīng)該等待分選柱中的液體流盡后,，將分選柱從磁力架上取下后,，并重新加入PBS將分選柱中的陽選細(xì)胞沖下，其中含有目的細(xì)胞,。計(jì)數(shù),，此后步驟同總淋巴細(xì)胞。
注意事項(xiàng)
1
由于整個(gè)過程需要淋巴細(xì)胞長時(shí)間處于體外PBS中,，所以對PBS的要求比較嚴(yán)格,；為保護(hù)淋巴細(xì)胞，也可以使用專門的淋巴細(xì)胞緩沖液，或自行配制含0.4%BSA的PBS緩沖液,；
2
有些研究為了更好地促進(jìn)淋巴細(xì)胞的殺傷功能,，還會(huì)在T細(xì)胞培養(yǎng)基中添加IL-2; 但是，很多人認(rèn)為這樣也會(huì)加速T細(xì)胞進(jìn)入T細(xì)胞耗竭的進(jìn)程,，同時(shí)會(huì)縮短T細(xì)胞壽命,；
3
若后續(xù)需要進(jìn)行流式分析，無法再染CD3 和 CD28分子,；
4
若用到了OT-I CD8 T細(xì)胞,，則無需CD3抗體刺激，而是用OVA抗原刺激活化第一信號(hào),；
5
以上所有操作均以無菌試劑,、耗材，無菌環(huán)境內(nèi)操作為前提,。
以上為淋巴細(xì)胞提取,、分選的經(jīng)驗(yàn)分享，希望對大家有所幫助,。同時(shí)也歡迎更多老師參與文獻(xiàn)獎(jiǎng)勵(lì)活動(dòng),，分享您的科研干貨和心得體會(huì)！
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