原代細胞分離是指將組織分散制成細胞懸液后從中獲取目的細胞的過程,，獲得高純度、高活性的原代細胞則是很多細胞實驗成功的關(guān)鍵要素之一，但是,，很多小伙伴會在這個關(guān)鍵步驟會出現(xiàn)問題,，今天我們就主要來聊聊這個問題。
首先,，原代細胞分離的方法有很多種：
原代細胞是直接取自活組織(例如活組織檢查材料)的細胞,，并建立用于體外生長。這些細胞經(jīng)歷了非常少的群體倍增,，因此與連續(xù)(腫瘤或人工永生化)細胞系相比,，它們更能代表它們所衍生組織的主要功能成分，使得原代細胞成為更具代表性的體內(nèi)模型,。
所以,，自己動手分離原代細胞，是非常有必要的,。
原代細胞分離方法有許多種：懸浮離心法,、直接組織塊法、酶消化法,、非酶消化法,、機械分散法等，今天,，我們主要來看看最-常用的方法——酶消化法,。
原代細胞分離提取優(yōu)化七步法
1、無菌
確保使用無菌設備,、試劑和技術(shù)收集和處理組織,。使用個人防護設備以避免污染。使用0.22微米的膜無菌過濾所有酶和試劑,。
2,、切塊
用無菌剪刀或手術(shù)刀將組織標本切成小塊(通常為2×4mm)，然后將小塊放入選定的緩沖液,、培養(yǎng)基或鹽溶液中,。
3、加酶
將組織清洗三次以消除多余的血液蛋白,，然后加入您選擇的酶如膠原酶,、蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶,。通常,，約0.5 mg/ml～1.5 mg/ml的酶。
4,、孵育
將組織樣本在其最佳溫度下孵育,，通常在37℃下孵育30～90分鐘,。定期混合或輕輕搖動標本。
5,、洗滌
通過輕輕移液來分散細胞(也稱為研磨),，然后，使用細網(wǎng)過濾細胞懸浮液,。讓細胞沉淀并潷出多余的含液酶;洗兩到三次,。含有FBS，BSA或其他抑制劑的洗滌溶液也可用于阻止酶消化,。
6,、分析
將細胞重懸于正確的培養(yǎng)基或緩沖液中，然后定量測定細胞產(chǎn)量和活力,。這是細胞分離過程中的重要步驟，因此您可以評估解離技術(shù)的結(jié)果,。大多數(shù)研究人員使用血細胞計數(shù)器測定細胞產(chǎn)量,，并使用臺盼藍重氮染料測量細胞活力。
7,、培養(yǎng)
這個適合,，就可以根據(jù)所分離的細胞來選擇最-適合研究的方案和處理步驟來培養(yǎng)細胞了。
重點注意事項：
1,、使用細胞分離酶時,，請注意溫度和濕度條件。如蛋白水解酶可以自動分解,，因此建議在使用前立即將其溶解,，并在冰上保存2°C～8°C。
2,、通常用于細胞分離的大多數(shù)酶可以直接溶解于平衡鹽溶液或所選緩沖液中,。對于許多細胞分離中，確保解離期間的組織存活,，需要孵育培養(yǎng)基充分氧化并在生理pH下緩沖,。95%O2、5%CO2平衡的介質(zhì)來完成,。
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