一,、 程序凍存步驟（需梯度降溫）
1、 配置凍存液,，凍存液推薦配比：55%（基礎(chǔ)培養(yǎng)基）+40%(血清)+5%（DMSO）或90%胎牛血清+10%DMSO,；推薦使用Procell通用血清型程序凍存液，貨號(hào)PB180436,；
2,、 制備好的細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，計(jì)算總細(xì)胞量,；
3,、 細(xì)胞離心后盡量吸干凈上清，離心轉(zhuǎn)速1200rpm（250g）3min,；
4,、 加入配置好的凍存液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106~1×107cells/mL,；
5,、 分裝入凍存管，一個(gè)凍存管分裝1~1.5毫升；
6,、 推薦使用程序降溫盒,，分裝好的凍存管轉(zhuǎn)入程序降溫盒后直接放入-80℃冰箱過(guò)夜；
7,、 如沒(méi)有程序降溫盒,，則按下列順序依次降溫：室溫→4℃ 20min→-20℃ 30min→-80℃過(guò)夜→液氮保存，注意轉(zhuǎn)移過(guò)程中要保冷,，避免產(chǎn)生溫差或凍存管融化；
8,、 從-80℃冰箱取出凍存管迅速轉(zhuǎn)移到液氮長(zhǎng)期保存,。
注意事項(xiàng)：
1、 DMSO配制的時(shí)候會(huì)放熱,，一定要等凍存液冷卻后使用,，避免灼傷細(xì)胞；
2,、 細(xì)胞離心后盡量吸干凈上清液,，減少培養(yǎng)基殘留，避免稀釋凍存液,；
3,、 不建議手動(dòng)梯度降溫，溫度不穩(wěn)定,，容易降低存活率,；
4、 注意程序降溫盒內(nèi)異丙醇的量必須高于最-低刻度線,；凍存5次后異丙醇需要更換一次,，以免影響凍存效果；程序降溫盒需恢復(fù)到室溫以后才能繼續(xù)使用,，不能從冰箱拿出來(lái)直接使用,；
5、 細(xì)胞懸液加入凍存液以后盡量短時(shí)間的在常溫放置,，DMSO常溫下對(duì)細(xì)胞損傷大,，分裝完成后立即轉(zhuǎn)入程序降溫盒放到-80度冰箱，不需要放4度,；
6,、 -80度凍存過(guò)夜后可以轉(zhuǎn)入液氮長(zhǎng)期保存，轉(zhuǎn)入液氮的過(guò)程需要對(duì)凍存盒進(jìn)行保冷,，不要長(zhǎng)時(shí)間在常溫暴露,，避免凍存管融化；
7、 若沒(méi)有液氮罐,，存放在-80度的時(shí)候一定要放靠里面的位置,，避免開(kāi)關(guān)冰箱導(dǎo)致溫度不穩(wěn)定。
8,、 細(xì)胞凍存后應(yīng)取出一管復(fù)蘇,，檢測(cè)細(xì)胞的存活率。理論上細(xì)胞可在液氮內(nèi)長(zhǎng)期保存,，為穩(wěn)妥起見(jiàn)可在細(xì)胞凍存半年后復(fù)蘇培養(yǎng),，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，再繼續(xù)凍存,；
二,、 非程序凍存步驟（需使用無(wú)血清凍存液）
1、 凍存液叢冰箱提前拿出回溫到室溫,，推薦Procell無(wú)血清非程序凍存液,，貨號(hào)PB180438；
2,、 制備好的細(xì)胞懸液計(jì)數(shù),，計(jì)算總細(xì)胞量；
3,、 細(xì)胞離心后盡量吸干凈上清,，離心轉(zhuǎn)速1200rpm（250g）3min；
4,、 加入無(wú)血清非程序凍存液（PB180438）重懸,，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106~1×107cells/mL；
5,、 分裝入凍存管,，一個(gè)凍存管分裝1~1.5毫升；
6,、 分裝好的凍存管直接轉(zhuǎn)入-80度冰箱過(guò)夜,，不需要程序降溫盒；
7,、 轉(zhuǎn)入液氮途中需將凍存管做好保冷措施,，避免直接暴露于常溫，快速轉(zhuǎn)入液氮罐進(jìn)行長(zhǎng)期保存,；
注意事項(xiàng)：
1,、 由于沒(méi)有使用凍存盒，在轉(zhuǎn)入液氮的過(guò)程中一定要對(duì)凍存管做好保冷措施,，不能直接用手拿,，可以用干冰或者少量液氮保護(hù)后轉(zhuǎn)移,，操作過(guò)程注意安全；
2,、 轉(zhuǎn)移過(guò)程要快,，避免凍存管暴露于常溫后融化；
3,、 若沒(méi)有液氮罐,，存放在-80度冰箱的時(shí)候一定要放靠里面的位置，避免開(kāi)關(guān)冰箱導(dǎo)致溫度不穩(wěn)定,；
三,、 細(xì)胞復(fù)蘇步驟
1、 將水浴鍋預(yù)熱至37℃,，準(zhǔn)備好干凈的一次性PE手套,，一個(gè)無(wú)菌離心管內(nèi)加入9ml無(wú)菌培養(yǎng)基；
2,、 將細(xì)胞從液氮罐中取出放入PE手套中，迅速?zèng)]入水浴鍋,，搖晃凍存管加速溶解,，以1分鐘內(nèi)全部溶解為宜；
3,、 在超凈臺(tái)中將復(fù)蘇好的細(xì)胞液加入到裝有新鮮培養(yǎng)基的離心管內(nèi),，1200rpm/min 離心3分鐘，離心完畢去掉上清,；
4,、 用適量與細(xì)胞對(duì)映的*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接入到無(wú)菌容器中（培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿）,，補(bǔ)充培養(yǎng)基到適宜,，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
注意事項(xiàng)：
1,、 水浴鍋的位置如果與液氮罐不是一個(gè)房間,，需要對(duì)凍存管進(jìn)行保冷后轉(zhuǎn)移到水浴鍋旁，避免路途細(xì)胞表面融化,；
2,、 細(xì)胞溶解過(guò)程快速搖晃以加速溶解；
3,、 已溶解的凍存細(xì)胞盡量短時(shí)間的在常溫存放,，盡快離心去除DMSO；
4,、 貼壁細(xì)胞復(fù)蘇24小時(shí)后觀察,，若密度達(dá)到80%,，則正常傳代；若密度不到80%則繼續(xù)培養(yǎng)到48小時(shí)再換液,；
5,、 懸浮細(xì)胞復(fù)蘇3天內(nèi)不建議離心換液；
6,、 對(duì)DMSO不敏感的細(xì)胞在復(fù)蘇時(shí)也可不離心,，減少操作步驟，也可降低污染的幾率,。將解凍的細(xì)胞懸液直接轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶?jī)?nèi),，補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng),。但培養(yǎng)12~24h后必須換新鮮的培養(yǎng)基,，移除死細(xì)胞。
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