英國(guó)Whatman3MM CHR雜交層析紙

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

掌握RNA印跡技術(shù)的基本原理,，學(xué)習(xí)RNA印跡技術(shù)的操作方法，了解RNA印跡技術(shù)的意義與應(yīng)用,。

【實(shí)驗(yàn)原理】

將RNA變性及電泳分離后,，轉(zhuǎn)移到固相支持物上，用于與DNA探針雜交以鑒定其中特定RNA分子的大小與含量,?；驹砼cSouthern印跡相同，但RNA變性方法與DNA不同,，不能用堿變性,，因?yàn)閴A會(huì)導(dǎo)致RNA的水解。

Northern印跡主要用于組織細(xì)胞靶基因表達(dá)水平的研究以及對(duì)同一組織細(xì)胞的不同基因間的表達(dá)水平進(jìn)行比較,，或者對(duì)不同組織細(xì)胞間相同基因的表達(dá)水平進(jìn)行比較,。

英國(guó)Whatman3MM CHR雜交層析紙【實(shí)驗(yàn)對(duì)象】

待測(cè)RNA樣品。

【試劑與器材】

1． 焦碳酸二乙酯 （DEPC）,。

2． 甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳所需試劑,。

3． 0.5 mol ／ L乙酸銨（NH4Ac）。

4． 溴化乙啶 （EB）：0.5μg／ml,，溶于0.5mol／L乙酸銨中。

5． 0.05mol ／ L NaOH／1.5mol／L NaCI（選用）。

6． 0.5mol ／ L Tris·CI （pH 7.4） ／1.5mol／L NaCl（選用）,。

7． 20×SSC,、6×SSC和2×SSC。

8． 亞甲藍(lán)（終濃度為0.03％）,，溶于0.3mol ／ L （pH 5.2）的乙酸鈉緩沖液中 （選用）,。

9． *纖維素 （NC） 膜或尼龍膜。

【實(shí)驗(yàn)方法與步驟】

1. RNA甲醛變性凝膠電泳（5V/cm, 3h）,（見(jiàn)附錄三）,。

電泳結(jié)束后用EB染色：取出凝膠,，切下需要染色的泳道，放置于無(wú)RNA酶的玻璃平皿,，加入0.5mol ／L乙酸銨浸泡20min,。換液再浸泡20min以除去甲醛，將凝膠轉(zhuǎn)入含0.5（g ／ ml EB的0.5mol ／L乙酸銨溶液中染色40min,，必要時(shí),，以0.5mol ／ L乙酸銨脫色1h。

3．在紫外透射儀中使凝膠中的RNA顯跡,，沿凝膠的邊緣放一把尺子拍照,，以便隨后能確定膜中的條帶。

4．將非染色的部分凝膠放置于無(wú)RNA酶的玻璃平皿中,，加足夠的DEPC處理的去離子水浸洗幾次以除去甲醛,。

5. 凝膠浸泡在10倍體積的0.05mol/L NaOH ／ 1.5mol/LNaCl中30min，使RNA部分水解,。接著浸泡于10倍體積的0.5mol/L Tris·C1（pH 7.4） ／ 1.5mol/LNaCl緩沖液中和30min （可選）, 將膠的多余部分切除,，并切邊標(biāo)記。

6． 將溶液換成10倍體積的20×SSC,，浸泡45min,。

7． 在一玻璃或塑料平皿中放置-塊比凝膠略大的有機(jī)玻璃作為平臺(tái)（必要時(shí)，可并排放兩塊或更多） ,，加入足夠的20×SSC以使平臺(tái)半淹沒(méi)在液體中,。

8． 構(gòu)筑轉(zhuǎn)移平臺(tái)，剪3張與平臺(tái)同樣大小的Whatman 3MM濾紙,，放在平臺(tái)表面,，以20×SSC潤(rùn)濕。把凝膠置于濾紙表面,，用玻棒滾動(dòng)表面以壓擠去除氣泡,。切4條塑料保鮮膜覆蓋在凝膠的邊緣。

9．剪一片與凝膠暴露面積大小相當(dāng)?shù)哪猃埬せ騈C膜,，在一個(gè)無(wú)RNA酶的玻璃平皿中加入約0.5mm深的用DEPC處理的去離子水,，將膜漂在水面使之潤(rùn)濕,，直至膜沉沒(méi)在水中。如果是尼龍膜,，只需讓膜在水中泡上5min,，如果是NC膜，則換成20×SSC再浸泡10min,。

10．將潤(rùn)濕的膜放在凝膠表面,，用干凈刀片切去濾膜一角，使其與凝膠的切角相對(duì)應(yīng),，排去氣泡,，以20×SSC漂洗膜表面。切 3張與膜大小相當(dāng)?shù)臐駶?rùn)的Whatman3MM濾紙,，放于膜的表面,。趕出氣泡。然后將與膜大小相當(dāng)?shù)募埥碚R地堆放在濾紙的表面,，高約4cm,。

11． 在紙堆的頂部放一塊玻璃平板，壓一重物 （0.2～0.4kg）,，放置12h左右,。

12．拆卸轉(zhuǎn)移裝置，回收膜和壓扁了的凝膠,。在膜上用鉛筆標(biāo)上加樣孔的位置和方向,。

13．用2×SSC洗膜，然后放于濾紙上,，讓膜于室溫干燥30分鐘,。NC膜則應(yīng)夾于2張Whatman 3MM濾紙之間，80℃真空干烤2h,。將干的轉(zhuǎn)印膜置于可透過(guò)紫外線的塑料保鮮膜中,，帶有RNA的一面朝下，置于紫外透射儀（波長(zhǎng)在254nm）上,，以合適的照射強(qiáng)度進(jìn)行紫外線交聯(lián),以固定RNA,。備作核酸雜交。

14． 凝膠可按步驟2,，用EB染色以檢查轉(zhuǎn)印效率,。