D407人視網(wǎng)膜色素上皮細胞

細胞特性

1） 來源：視網(wǎng)膜

2） 形態(tài)：上皮細胞樣,，貼壁生長

3） 含量：>1x10^6 個/mL

4） 污染：支原體,、細菌,、酵母和真菌檢測為陰性

5） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

D407人視網(wǎng)膜色素上皮細胞運輸和保存

可選擇干冰運輸及發(fā)送復(fù)蘇存活細胞方式

（1）干冰運輸，收到后立即轉(zhuǎn)入液氮或者-80度冰箱凍存或直接復(fù)蘇,；

（2）存活細胞,，收到后應(yīng)繼續(xù)生長，傳代達到細胞生長狀態(tài)良好時,，再進行凍存,。具體操作見細胞培養(yǎng)步驟。

（3）收到細胞后請拍照,，3天內(nèi)如果發(fā)現(xiàn)污染,，請及時拍照與我們聯(lián)系。

細胞用途：僅供科研使用,。

細胞接收后的處理：

1） 收到細胞后,，請檢查發(fā)貨培養(yǎng)瓶的狀況，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損,、有液溢出及細胞有污染,，請拍照后及時聯(lián)系我們。

2） 在顯微鏡下確認細胞生長狀態(tài)時,，最好在低倍鏡（4或5X物鏡)下進行,，能準(zhǔn)確判斷細胞的傳代密度?？醇毎男螒B(tài)請在10X和20×物鏡下,，同時給剛收到的細胞拍照，（10×,，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存,，作為細胞需要售后時提供收到細胞時細胞狀態(tài)的依據(jù),。

3） 觀察好細胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h,。

4） 貼壁細胞：在運輸過程中貼壁細胞會有脫落的現(xiàn)象,，如發(fā)現(xiàn)貼壁細胞有脫落或者脫落后抱團生長，可將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h,，然后抽出瓶中的培養(yǎng)基和未貼壁細胞1000rpm離心5分鐘,，棄去上清重懸后接種到加有按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基的原培養(yǎng)瓶中（或新的培養(yǎng)瓶中）。

5） 懸浮細胞：T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h,，然后抽出瓶中的培養(yǎng)基和細胞1000rpm離心5分鐘,，棄去上清重懸后接種到新的培養(yǎng)瓶中（加入按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基）。

6）備注：運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細胞,，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞,。  收到細胞后第一次傳代建議1：2傳代 。           

細胞培養(yǎng)步驟

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備DMEM（推薦0001）培養(yǎng)基,；優(yōu)質(zhì)胎牛血清,，10%；雙抗,，1%,。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%,；二氧化碳,，5%。 溫度：37攝氏度,，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%,。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO,，現(xiàn)用現(xiàn)配,。

二． 細胞處理：

1） 復(fù)蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻,。在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?50px皿中,，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）,。第二天換液并檢查細胞密度,。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細胞,，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次,。

2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘,，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化,。

3. 按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出,，在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。

4. 收到細胞后首ci傳代推薦將細胞懸液按1：2的比例分到新的含6ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,，建議凍存一支備用，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2到1:5的比例進行,。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時,，可進行細胞凍存。

下面T25瓶為例,；

1．細胞凍存時,，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶,，細胞變圓脫落后,，加入2ml*培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù),。

 2．1000RPM離心5分鐘去掉上清,。用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%,。加入DMSO后迅速混勻,，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中，注意凍存管做好標(biāo)識,。本公司按每個凍存管細胞數(shù)目大于1x10^6個細胞凍存,。

3．將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱,，至少2個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存,。記錄凍存管位置以便下次拿取。