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小鼠心肌細(xì)胞傳代,、凍存,、復(fù)蘇說明
小鼠心肌細(xì)胞傳代、凍存,、復(fù)蘇說明
小鼠心肌細(xì)胞傳代：
1）細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí),，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次,；
2）添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中,，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入完全培養(yǎng)液終止消化,，再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落,，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min,；
3）棄上清,，沉淀細(xì)胞用12ml完全培養(yǎng)基重懸，然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代,，最后放入37℃,，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
小鼠心肌細(xì)胞凍存：
1）細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí),，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,，用PBS清洗細(xì)胞一次；
2）添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中,，倒置顯微鏡下觀察,，待細(xì)胞回縮變圓后加入完全培養(yǎng)液終止消化,，輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,，1000rpm離心5min,；
3）用適量的凍存液（FBS：DMSO=9 ：1）重懸細(xì)胞，并放置于凍存管中,；
4）先將細(xì)胞凍存管放置于-20℃ 1.5h,，然后將其移入-80℃過夜,，24h后轉(zhuǎn)入液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期保存,。使用程序降溫盒可直接放入-80℃。
4,、細(xì)胞復(fù)蘇：
1）從液氮中取出細(xì)胞凍存管（注意：佩戴防爆管面具）,，快速將其置入37℃水浴中解凍，直至凍存管中無結(jié)晶,，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁,；
2）將凍存管中的細(xì)胞移至含5ml完全培養(yǎng)基的15ml離心管中， 1000rpm離心5min,；
3）棄上清,，沉淀用5ml完全培養(yǎng)基重懸，接種25cm2培養(yǎng)瓶,，于37℃,，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。