大鼠肝癌細(xì)胞常見(jiàn)問(wèn)題及解決：

細(xì)胞漂?。号囵B(yǎng)瓶不開(kāi)封，瓶口酒精擦拭后平躺放置在培養(yǎng)箱。次日觀察,，如細(xì)胞大部分又貼回瓶底，表明細(xì)胞活力正常,，剩余漂浮的細(xì)胞可以離心去掉,，留10ml培養(yǎng)液培養(yǎng)觀察，細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度80%,，進(jìn)行消化傳代,；如細(xì)胞還是不貼壁，將細(xì)胞離心收集轉(zhuǎn)到新培養(yǎng)瓶,，原培養(yǎng)瓶加部分培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),，中間注意觀察，我們的技術(shù)人員會(huì)一直跟蹤技術(shù)指導(dǎo),，直到問(wèn)題解決,。

注意事項(xiàng)

1.  取細(xì)胞的過(guò)程中注意帶好防凍手套，護(hù)目鏡,。此項(xiàng)尤為重要,，細(xì)胞凍存管可能漏入液氮，解凍時(shí)凍存管中的氣溫急劇上升,，可導(dǎo)致爆炸,。

2.  凍存液的問(wèn)題：凍存液的配置已是常識(shí)，在這里不作詳述,，但二甲基亞砜（DMSO）對(duì)細(xì)胞不是*無(wú)毒副作用,，在常溫下，二甲基亞砜對(duì)細(xì)胞的毒副作 較大,，因此,，必須在1-2min內(nèi)使凍存液*融化。如果復(fù)蘇溫度太慢,，會(huì)造成細(xì)胞的損傷,，二甲基亞砜（DMSO）選擇進(jìn)口產(chǎn)品。

3.  離心前須加入少量培養(yǎng)液,。細(xì)胞解凍后二甲基亞砜濃度較高,，注意加入少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度,，以減少對(duì)細(xì)胞的損傷。

4.  離心問(wèn)題：目前主要有兩種見(jiàn)解,。一種是解凍后的細(xì)胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng),，第二天換液。因?yàn)殡x心的目的是兩個(gè),，去除 DMSO,，去除死細(xì)胞，這個(gè)是標(biāo)準(zhǔn)流程,，但對(duì)一般人來(lái)說(shuō),，把握不好離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間，轉(zhuǎn)的不夠活細(xì)胞沉底的少,，細(xì)胞就全被扔掉了,，轉(zhuǎn)過(guò)了活細(xì)胞會(huì)受壓過(guò)大， 死亡,。此外在操作過(guò)程中容易污染,，所以不推薦。另一種說(shuō)法為細(xì)胞懸液中含有二甲基亞砜（DMSO）,，DMSO對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用,，所以須將離心后的液 體前倒凈，且一定倒干凈,。我在試驗(yàn)中按照常規(guī)的離心分裝的方法進(jìn)行復(fù)蘇,，結(jié)果無(wú)有異常。

5.  細(xì)胞貼壁少的問(wèn)題：教科書(shū)中說(shuō)明凍存細(xì)胞解凍時(shí)1ml細(xì)胞液要加10ml－15m培養(yǎng)液,，而在我的試驗(yàn)中的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)為培養(yǎng)基越少細(xì)胞越容易貼附,。

6.  復(fù)蘇細(xì)胞分裝的問(wèn)題：試驗(yàn)中我的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)為復(fù)蘇1管細(xì)胞一般可分裝到1-2只培養(yǎng)瓶中，分裝過(guò)多,，細(xì)胞濃度過(guò)低,，不利于細(xì)胞的貼壁。