PriCells: 碘克沙醇梯度提取哺乳動(dòng)物原代細(xì)胞過氧化物酶體                                           

試劑和器材： 
1. OptiPrepTM（600g/L的碘克沙醇）,；
2. 勻漿介質(zhì)：0.25mmol/L蔗糖溶液、1mmol/L乙二胺四乙酸,、1g/L乙醇,、5mmol/L 3-嗎啉基丙磺酸（MOPS），pH7.2,；
3. 稀釋劑：6mmol/L乙二胺四乙酸,、6g/L乙醇、30mmol/L MOPS,，pH7.2,；
4. 1mol/L 蔗糖溶液；
5. 按要求向勻漿介質(zhì)和稀釋劑中加入蛋白酶抑制劑,；
6. 使用勻漿介質(zhì)制備好的線粒體組分,；
7. Dounce勻漿器（10ml寬松配制，Wheaton B型）,；
8. 兩室梯度制備儀或Gradient MasterTM,；
9. 5ml注射器（內(nèi)徑大約為0.8mm），帶金屬套管針,；
10. 超速離心機(jī),，配有容納30—40ml體積的固定角離心轉(zhuǎn)子，最大轉(zhuǎn)速大約為100000g,，另帶大約30ml容量的厚壁管,；
11. 梯度收集器；

實(shí)驗(yàn)方法：
哺乳動(dòng)物原代細(xì)胞培養(yǎng),。
原代細(xì)胞收集后,，所有操作均在0—4℃進(jìn)行。
1. 使用碘克沙醇,、稀釋劑,、1mol/L蔗糖溶液和水分別根據(jù)不同的體積比配制一下梯度溶液：500g/L碘克沙醇（5+0.6+0.4+0.0）、400g/L碘克沙醇（4+0.6+0.7+0.7）和200g/L碘克沙醇（2+0.6+1.1+2.3）,；
2. 使用寬松配制的Dounce勻漿器在勻漿介質(zhì)中對(duì)線粒體沉淀進(jìn)行重懸（研杵研磨2—3次）,，相應(yīng)地調(diào)整使得每克組織對(duì)應(yīng)0.5ml體積；
3. 使用兩室梯度制備儀或者Gradient MasterTM來制備線性梯度，使用注射器和金屬套管針從200g/L和400g/L的碘克沙醇溶液中各取9ml,，制備梯度溶液并置于適用于固定角離心轉(zhuǎn)子的聚碳酸酯管中,，每個(gè)梯度最底層均為2ml的500g/L碘克沙醇；
4. 在每個(gè)梯度溶液上層加入3ml混懸液,，然后在105000g下離心1h,；
5. 讓轉(zhuǎn)子從1000r/min開始持續(xù)減速，將梯度溶液收集于1ml中,，密度越大的可越先得到收集,。或者也可以用注射器和金屬套管針來收集沿梯度溶液往下2/3距離上形成帶的過氧化物酶體,；