PriCells: 原代細(xì)胞周期測(cè)定的原理和BrdU方法                              

原理:
細(xì)胞周期:細(xì)胞一世代所經(jīng)歷的時(shí)間從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束一個(gè)周期,。細(xì)胞周期反應(yīng)了細(xì)胞增殖速度。單個(gè)細(xì)胞的周期測(cè)定可采用縮時(shí)攝影的方法,，但它不能代表細(xì)胞群體的周期，故現(xiàn)采用其他方法測(cè)群體周期。
測(cè)定細(xì)胞周期的方法很多,，有同位素標(biāo)記法、細(xì)胞計(jì)法等,。
BrdU（5溴脫氧尿嘧啶核苷）加入培養(yǎng)基后,，可做為細(xì)胞DNA復(fù)制的原料，經(jīng)兩個(gè)細(xì)胞周期后,，細(xì)胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2,，反映在染色體上應(yīng)表現(xiàn)為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個(gè)周期,，則染色體中約一半為兩條單體均淺染,，另一半為一深一淺,。細(xì)胞如果僅經(jīng)歷了一個(gè)周期，則兩條單體均深染,。計(jì)分裂相中各期比例,，就可算出細(xì)胞周期的值。

試劑

1,、儀器,、用品：同常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)
2、試劑：BrdU（1.0mg/ml）,，甲醇,、冰醋酸，Giemsa染液,，秋水仙素,，2×SSC液

BrdU方法
　　1、原代細(xì)胞生長至指數(shù)期時(shí),，向培養(yǎng)液中加入BrdU,，最終濃度為10μg/ml。
　　2,、44小時(shí)加秋水仙素,，使每ml中含0.1μg。
　　3,、48小時(shí)后常規(guī)消化細(xì)胞至離心管中,，注意培養(yǎng)上清的漂浮細(xì)胞也要收集到離心管中。
　　4,、常規(guī)染色體制片,。
　　5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上,，鋪上2×SSC 液,，距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。
　　6,、棄去2×SSC液,，流水沖洗。
　　7,、Giemsa液染色10分鐘,，流水沖洗，晾干,。
　　8,、鏡檢100個(gè)分裂相，計(jì)第一,、二,、三,、四細(xì)胞期分裂指數(shù)。
　　9,、計(jì)算：細(xì)胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小時(shí)）
附：
（1）BrdU配制：BrdU 10mg十雙蒸水10ml 4℃下避光保存,。
（2）2×SSC配制：NaCl 1.75克，檸檬酸三鈉•2H2O 0.88克,，加水至100ml,，4℃保存。