PriCells: 正常人角膜上皮細(xì)胞和干細(xì)胞的分離

實(shí)驗(yàn)材料：
1. 完整的人角膜,；
2. GMF-Saline G,；
3. 中性蛋白酶Ⅱ,，1.2U/ml（用DMEM/F12/GASP稀釋2.4U中性蛋白酶Ⅱ）；
4. 胰蛋白酶/EDTA,；
5. DMEM/F12/GASP,；
6. DEME/F12/2FB/GASP：DMEM/F12/GASP含2%FBS；
7. CMF/GASP,；
8. LSC培養(yǎng)基,；
9. 彎虹膜剪，11cm（4-3/8in）,；
10. Jeweler’s鑷,，10cm（4in）；
11. 角膜剪,，19mm刃,，尖頭；
12. Colibri縫紉鉗，0.1mm,；

實(shí)驗(yàn)方法：
1. 清洗角膜3×5min,；
2. 剪除殘留的鞏膜，結(jié)膜和虹膜,；
3. 加入2ml中性蛋白酶Ⅱ,，4℃過夜，輕微攪動(dòng),；
4. 將加入中性蛋白酶Ⅱ的角膜放入4℃搖床搖30min,；
5. 用DMEM/F12/GASP清洗角膜；
6. 解剖顯微鏡下,，小心去除角膜中央的上皮細(xì)胞（此時(shí)多數(shù)的中央上皮細(xì)胞已經(jīng)剝脫）并除去角膜緣包含有Vogt柵欄區(qū)的色素上皮細(xì)胞,；
7. 用胰蛋白酶/EDTA消化角膜緣上皮細(xì)胞片37℃，10min,；
8. 加入等體積DMEM/F12/2FB/GASP,；
9. 400g離心10min，棄上清,；
10. 用DMEM/F12/2FB/GASP洗一遍,，離心，棄上清,；
11. 加入LSC培養(yǎng)基,，將細(xì)胞拍散并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)；
12. 將細(xì)胞以1×10⁴/cm²的密度接種至鋪有3T3飼養(yǎng)層的組織培養(yǎng)皿或準(zhǔn)備好的人羊膜上,；
13. 每三天更換一次培養(yǎng)基,；
14. 當(dāng)細(xì)胞達(dá)90%匯合時(shí)用胰蛋白酶消化傳代：