基本原理：

吖啶橙（acridine orange,，AO）是一種常用熒光染料,，吖啶橙與原代細(xì)胞內(nèi)的DNA,、RNA都有親和力，但有一定的特異性,，即結(jié)合后發(fā)不同顏色的熒光,，DNA呈亮綠色，而RNA呈橘紅色至火紅色,。此法簡(jiǎn)便快捷,，既可染活原代細(xì)胞又可染固定原代細(xì)胞。用于直接染色觀察活原代細(xì)胞或固定染色觀察原代細(xì)胞均可,。吖啶橙對(duì)活原代細(xì)胞毒性小,，配成1×10^-4—2×10^-4可用于直接染色活原代細(xì)胞和進(jìn)行熒光顯微鏡觀察，但不持久,，用固定染色觀察法效果更好,。

材料：

1.       蓋片單層培養(yǎng)原代細(xì)胞；

2.       固定劑：95%乙醇或乙酸/甲醇（現(xiàn)配）,；

3.       吖啶橙：用生理鹽水配成1%的干液,。使用時(shí)再用PBS稀釋成1×10^-4—2×10^-4mol/L pH4.5—5.0的染色液；

4.       0.1mol/L的CaCl₂,；

5.       1%乙酸,；

染色步驟：

1.       將蓋片單層培養(yǎng)原代細(xì)胞從瓶中取出，立即用溫Hanks液漂洗3—5s,，以去除培養(yǎng)基中血清,；

2.       投入95%乙醇或乙酸/甲醇固定15—30min，用濾紙接觸蓋片邊緣,，蓋片微干,；

3.       用1%乙酸酸化30s；

4.       用1×10^-4—2×10^-4的吖啶橙染液染色30s或1min,；

5.       用0.1mol/L的CaCl₂處理30s—2min,；

6.       PBS漂洗3次，每次數(shù)秒,；

7.       PBS封片,，熒光顯微鏡下直接觀察并拍照；

8.       注意事項(xiàng)：觀察中應(yīng)隨時(shí)填加PBS以避免標(biāo)本干涸。如用油浸鏡觀察,，需再覆以大蓋片蓋在附有原代細(xì)胞蓋片上,，保證原代細(xì)胞面朝上，用無熒光性油浸鏡觀察,。原代細(xì)胞蓋片標(biāo)本在95%乙醇中能保存數(shù)日后仍可觀察,，如退色，再用AO染色,。鏡下觀察,，DNA呈翠綠色，RNA呈火紅色,。

結(jié)果：

原代細(xì)胞核因含DNA呈綠色,，細(xì)胞質(zhì)及核仁因含RNA呈紅色,；