PriCells: 正常人表皮黑色素細(xì)胞的培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)材料：

1. 臨床活檢獲取的正常人皮膚材料或新生兒yin莖包皮；

2. 不含Ca2+和Mg2+的1×PBS,，添加200000IU/L青霉素,、200mg/L鏈霉素，pH7.2；

3. 黑素細(xì)胞培養(yǎng)液和培養(yǎng)基中各種添加劑的配制：包括以下種類：①胰島素,。貯存液為5mg/ml，即將0.5g的胰島素溶于1ml 0.01mol/L的HCl液中,，雙蒸水加至100ml,，過濾除菌、分裝,，-70℃下保存6個月后方可使用,。使用時，在500ml培養(yǎng)基中加0.5ml胰島素貯存液,，即終濃度為5μg/ml,；②表皮生長因子。貯存液濃度為5μg/ml,，其配制方法是,，取0.1mg的表皮生長因子溶于20ml的無Ca2+和Mg2+的D-Hanks液中，以0.2μm孔徑的濾膜過濾除菌,，按1ml分裝,，-70℃下保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r,，在500ml培養(yǎng)液中加0.5ml表皮生長因子貯存液,，即終濃度為5ng/ml；③十四煥酰法佛醋酸酯（TPA）,。貯存液濃度為0.25mg/ml,，配制時將10mg TPA溶于40ml的100%的酒精中，分裝后用Parafilm密封,，于-20℃保存?zhèn)溆?。使用時，在500ml培養(yǎng)基中加20μl的TPA貯存液,，即終濃度為10ng/ml,；④黑素細(xì)胞培養(yǎng)液：MCDB153培養(yǎng)基，使用時添加2mmol/L CaCl2,，以4:1比例（V/V）添加Leibovtz L-15,、2%胎牛血清、5μg/ml胰島素,、5ng/ml表皮生長因子和10ng/mlTPA,，并加入40μg/ml的牛垂體提取物。4℃下保存?zhèn)溆谩?/span>

4. 其它培養(yǎng)用液：①皮膚材料保存液。主要用于不能即刻進(jìn)行細(xì)胞分離的皮膚材料的保存,。為無Ca2+和Mg2+的D-Hanks液,，使用時添加100 IU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素、100μg/ml慶大霉素和0.25μg/ml兩性霉素B,，過濾除菌后備用,；②表皮消化液。為0.25%的胰蛋白酶溶液,。用2.5%的胰蛋白酶溶液0.5ml加4.5ml的無Ca2+,、Mg2+的D-Hanks液；③細(xì)胞分散液,。主要用于細(xì)胞分離消化過程中防止細(xì)胞聚集形成團(tuán)塊,。用MCDB153培養(yǎng)基配制含1.25U/ml中性蛋白酶、0.1%（V/V）透明質(zhì)酸酶和10%胎牛血清即成細(xì)胞分散液,，另添加2mmol/L CaCl2,。使用時按4:1（V/V）的比例與Leibovtz L-15混合；④胰蛋白酶-Versene液,。為5×的貯存液,，即將2.5%胰蛋白酶溶液0.5ml加入100ml Versene液中。使用時,，用無Ca2+和Mg2+的D-Hanks液將5×的貯存液稀釋到終濃度胰蛋白酶為0.05%,，Versene為0.02%；⑤細(xì)胞冷凍保存液,。95%胎牛血清加入5%二甲基亞楓,。

用于黑色素細(xì)胞培養(yǎng)牛垂體提取物的制備：

1．稱取牛垂體腺組織25—30g（可于-70℃低溫保存）；

2．解凍并用無菌雙蒸水漂洗垂體組織,；

     3．以每克組織加2.38ml冷的0.15mol/L NaCl溶液的比例,，在振蕩器上振蕩分散腺垂體組織，使其成為組織碎片,，時間不超過30min,，并維持其低溫狀態(tài)。然后將混合液移入2L的溶劑瓶中,；

    4．在2L溶劑瓶中攪動垂體組織90min,；

5. 以12000r/min離心45min；

6. 將上清液收集在透析袋中,，用1×PBS液于4℃下進(jìn)行透析,。每天更換透析液1次，共透析3d,；

7. 用0.45μm的低蛋白結(jié)合濾膜過濾去除微小細(xì)胞碎片,，再用0.2μm微孔濾膜過濾除菌。分裝成每5ml一個包裝單位，于-70℃保存,。保存至6個月后才使用,。一旦解凍立即加入培養(yǎng)基中使用；

8. 可測定提取物中蛋白質(zhì)含量,，并滴定培養(yǎng)基中最佳提取物用量（大約為40μg/ml）,；

實(shí)驗(yàn)方法：

1. 先將皮膚材料用70%的乙醇浸泡30min，再用D-Hanks液沖洗去掉乙醇,。然后切開皮膚，用組織剪剪去脂肪和皮下組織,，并用外科手術(shù)刀片將處理過的皮膚材料切成2mm×3mm大小的皮片,；

2. 將切好的皮膚組織皮片移入離心管中，加入表皮消化液,，蓋緊,，搖勻。于4℃冰箱中孵育18—24h,；

3. 棄去表皮分離液,，加入D-Hanks液沖洗；

4. 分離表皮（透明層）與真皮（較厚而不透明）,。用鑷子夾住皮膚的真皮部分,，將表皮面黏貼向干燥的培養(yǎng)皿底，輕柔地沿其表面將真皮組織與表皮剝離,；

5. 將細(xì)胞分散液滴在分離后的表皮皮片上以免使表皮干燥,。用細(xì)胞分散液將表皮皮片收集到離心管中，于37℃下,，旋轉(zhuǎn)搖動孵育2—4h（時間長短取決于細(xì)胞的分散程度,，而搖動可促使游離細(xì)胞不斷地從皮片中分離出來）；

6. 室溫下,，用D-Hanks液離心洗滌分散細(xì)胞懸液3次（每次2000r/min,，5min）。洗滌時棄去可能含有膠質(zhì)層的上清液,；

7. 細(xì)胞沉淀后,，用黑素細(xì)胞生長培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),。按2×105個/cm2的細(xì)胞密度種植,，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48—72h,；

8. 細(xì)胞種植48h后,，換液去除未貼壁細(xì)胞。以后每周更新培養(yǎng)液2次。如果較多成纖維細(xì)胞的生長,，可用含200μg/ml遺傳霉素的黑素細(xì)胞培養(yǎng)液處理2—3d,，以抑制成纖維細(xì)胞的生長；

9. 2周內(nèi)可獲得融合70%的原代培養(yǎng)細(xì)胞,。將細(xì)胞培養(yǎng)物用胰蛋白酶-Versene液在室溫下消化1min.,，用含10%胎牛血清Leibovtz L-15培養(yǎng)液終止消化并收集細(xì)胞懸液。200r/min下離心3min,。用黑素細(xì)胞培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞,，計(jì)數(shù)。以104個/cm2細(xì)胞密度種植傳代細(xì)胞,。每周更新培養(yǎng)液2次,；

10. PriCells-原代表皮細(xì)胞特制基礎(chǔ)培養(yǎng)基；

11. PriCells-原代表皮細(xì)胞培養(yǎng)特制添加劑,；

12. PriCells-原代細(xì)胞分離試劑盒,；

13. PriCells-原代細(xì)胞鑒定試劑盒；