PriCells: 正常人乳腺上皮細胞培養(yǎng)

實驗材料：

1. 人哺乳期早期或斷奶后乳汁,。

2. 培養(yǎng)液：RPMI1640，15%FBS,，10%人血清,，50μg/ml霍亂毒素，0.5mg/ml氫化可de松,，1mg/ml胰島素,。

3. HuS（human serum）：血庫過期的血清，澳大利亞抗原陰性,。5cm Nunc塑料培養(yǎng)皿,。

4. 不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加200000IU/L青霉素,、200mg/L鏈霉素和200000U/L慶大霉素,，pH7.4。

5. 培養(yǎng)用液：1mg/ml胰島素（Sigma）：用6mmol/L鹽酸配制,；0.5mg/ml氫化可de松：用生理鹽水配制,；50μg/ml霍亂毒素（Schwartz-Mann）：用生理鹽水配制。

P.S：血清和儲存?zhèn)溆玫囊葝u素、氫化可de松,、霍亂毒素,、胰酶和胰蛋白酶應在-20℃條件下保存。

6. 消化液（TEGPED）：胰蛋白酶液：加入13mmol/L EGTA 10ml,，用PBSA配置,。

7. 7 mmol/L EDTA：4ml，用PBSA配置,。

8. 0.2%胰蛋白酶（Difco）：4ml,，用HBSS配置。

9. 1%胰酶：2ml,，用HBSS配置,。

實驗方法：

1. 于產(chǎn)后2-7d收集乳汁。用無菌水擦洗乳房,，將乳汁擠入無菌容器,。將收集的乳汁混合后，用RPMI1640稀釋,，以利于離心,。

2. 將稀釋的乳汁離心（600-1000g，20min）后,，輕輕吸去上清,。為了避免影響沉淀細胞，應留有少量液體,。用含有5%FBS的RPMI1640洗細胞2-4次,，直至上清不渾濁。

3. 用生長培養(yǎng)液混懸細胞,，將50μl細胞懸液加入含6ml培養(yǎng)液的5cm培養(yǎng)皿中,。在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)細胞,。

4. 3-5d后換液,，以后每周換液2次，6-8d出現(xiàn)克隆,。開始時,，有巨噬細胞混雜生長，起著飼養(yǎng)細胞的作用,?？寺≡龆嗪缶奘杉毎饾u消失。

5. 傳代培養(yǎng),。細胞長滿底壁80%-85%時，可傳代。每個5cm培養(yǎng)皿1.5ml加入TEGPED,，在37℃條件下用,，孵育細胞5-15min。然后,，混懸細胞,。

6. 離心（100g，5min）后,，用培養(yǎng)液混懸細胞,，將細胞懸液稀釋3倍。將細胞懸液接種到培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中,，每3個培養(yǎng)皿或每1個培養(yǎng)瓶2ml,。

7. PriCells-原代上皮細胞特制基礎培養(yǎng)基。

8. PriCells-原代上皮細胞培養(yǎng)特制添加劑,。

9. PriCells-原代細胞分離試劑盒,。

    10. PriCells-原代細胞鑒定試劑盒。