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PriCells: 從小鼠脾臟分離小鼠天然殺傷細胞
PriCells: 從小鼠脾臟分離小鼠天然殺傷細胞
基本方案：
由于所用Mab只能檢測C57BL背景小鼠體內(nèi)的NK1.1CD3-NK細胞,，故本方案適用于C57BL/6或者C57BL/10（以及H2b,、d、q同系小鼠）小鼠脾臟細胞,。
清楚雜細胞所用的單克隆抗體的活性對本方案至關(guān)重要,。單克隆抗體可以買到,，并且其雜交瘤可以從ATCC得到，因此建議檢測單克隆抗體的活性以保證實驗成功,。最佳補體和細胞濃度也需要通過實驗確定,。
實驗材料：
1. C57BL/6或者C57BL/10小鼠
2. Tris/NH4Cl裂解緩沖液
3. HBSS/3%（V/V）FBS
4. 10×單克隆抗體儲存液
5. GK1.5（ATCC號TIB207）、53-6.72（TIB105）,、M5/114.15.2（TIB120）,、J11d.2（TIB183；PharMingen）
6. 單克隆抗體MAR18.5（TIB216,；PharMingen）濃度1mg/ml
7. 含酚紅的HBSS（Life Technologies）/10%（V/V）FBS
8. 低Tox-M兔補體,，無菌復(fù)溶
9. 淋巴細胞M密度梯度分離液（Accurate Chemical and Scientific），室溫
10. RPMI-10*培養(yǎng)基
11. FITC標記的抗CD3抗體和PE標記的PK136抗體（PharMingen）
12. 15ml和50ml帶蓋聚丙烯錐底離心管
13. Beckman CS-6R離心機（或同類離心機）
14. 血清學(xué)吸管
實驗方法：
1. 處死小鼠,，無菌取脾臟,。
2. 制備脾臟細胞懸液，置于50ml離心管中,，避免將纖維性雜質(zhì)移入離心管,。200g離心5min以洗滌細胞。采用“去除脾臟細胞懸液中的紅細胞"的方法裂解紅細胞,，或使用Tris/NH4Cl裂解緩沖液,。每個脾臟的細胞用1ml HBSS/3%（V/V）FBS混懸。
3. 用臺盼藍拒染法計數(shù)活細胞,。用HBSS/3% FBS混懸細胞至5×107個細胞/ml,。置于冰上保存。
4. 制備下述單克隆抗體的10×混合溶液（10×每種抗體的飽和濃度）：
GK1.5（抗CD4）
35-6.72（抗CD8）
M5/114.15.2（抗I-A和I-Ed,k）
J11d.2（抗CD24）
5. 每0.9ml細胞懸液加入0.1ml單克隆抗體混合液,，4℃孵育30min,。
6. 用冰的HBSS/3% FBS洗細胞2遍，4℃,，200g離心5min,，棄上清。用10ml冰的HBSS/3% FBS混懸細胞再洗一遍,。將細胞用HBSS/10% FBS混懸至濃度5×107個細胞/ml,。
7. 加入10mg/ml抗大鼠κ（MAR18.5；1mg/ml儲存液）和低Tox-M兔補體至細胞懸液使其達到最佳終濃度（通常1：6,，但需要根據(jù)經(jīng)驗確定）,。37℃孵育45min，每15min振搖一次,。
8. 用HBSS/10% FBS洗一遍（步驟6）,。
9. 用5ml HBSS/10% FBS混懸細胞。取少量細胞懸液采用臺盼藍拒染法計數(shù)活細胞,，以確定補體裂解效果,。
10. 將5ml室溫的淋巴細胞M密度梯度分離液加入到一個15ml離心管中,。將5ml細胞懸液輕輕加在分離液上。室溫,，200g離心20min,，使離心速度緩慢下降。
11. 用吸管從界面小心吸取液體,，放在另一個15ml離心管中,。必要時可將界面放在白色背景前以便看清。用RPMI-10*培養(yǎng)基洗2遍（方法同步驟6）,。臺盼藍染色計數(shù)活細胞,，備用。
12. 為檢驗細胞純度,，可加入終濃度為10mg/ml的抗CD3-FITC和PK136-PE（抗NK1.1）抗體,，進行流式分析。
附錄：
HBSS/10%（V/V）FBS和HBSS/3%（V/V）FBS：
56℃ 45min熱滅活FBS,，過濾。取HBSS,，加入不同量的FBS,，分別配置含10%和3%（V/V）FBS的HBSS溶液。在10%FBS的HBSS溶液中加入酚紅,，而3%FBS的溶液不加酚紅,，以示區(qū)分。4℃可保存6個月,。
大鼠補體,，低Tox-M，無菌復(fù)溶：
將凍干的低Tox-M大鼠補體（Accurate Chemical and Scientific）用無菌的HPLC級的純水溶解,，臨用前配置,。如需要，可以用0.45mm濾膜過濾除菌,。滴定法測定每批次產(chǎn)品的細胞毒活性,。記住始終置于冰上操作。凍存時迅速置入-70℃冰箱中,，于-70℃可保存6個月,。
Tris/NH4Cl裂解緩沖液：
90ml 0.16mol/L（8.3g/L）NH4Cl
10ml 0.17mol/L Tris·Cl，pH7.65
用HCl調(diào)pH至7.2
過濾除菌
室溫可保存3個月