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小鼠骨骼肌細胞培養(yǎng)
PriCells –正常小鼠原代骨骼肌細胞培養(yǎng)
一、實驗試劑
1,、培養(yǎng)基： PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement
2、凍存液： PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO
3,、洗滌液： 1 × PBS （pH 7.4 ）+ 1% P/S
4,、染色液： 0.4% Trypan Blue
5、消化液： PriCells Isolation of Primary Cell Kit
6,、檢測試劑：鼠抗人及大鼠desmin一抗,，肌球蛋白（myosin）單克隆抗體
二、實驗器械
1,、培養(yǎng)皿
2,、培養(yǎng)瓶
3、直剪和眼科剪
4、眼科鑷和止血鉗
5,、燒杯
6,、15ml離心管
三、實驗流程
取肌肉于平皿,，Hank’s洗3次
↓
剔除脂肪,、結(jié)締組織
↓
肌肉標本剪約0.1cm3小塊
↓
移至離心管，Hank’s洗3次
↓
靜置1min,，棄去上層液及漂浮組織
↓
0.25%胰酶,，37度水浴消化20min，每5min搖動或吹打1次
↓
生長培養(yǎng)基終止消化,，反復吹打,，依次100，200,，400目過篩
↓
離心,，1000rmp,10min，棄去上清
↓
重懸,，計數(shù)細胞,，接種密度以5 × 105個/ml
↓
懸液加入未經(jīng)PPL包被培養(yǎng)瓶中，差速貼壁去除成纖維細胞,，37度,，1h
↓
轉(zhuǎn)移包被瓶中，生長培養(yǎng)基培養(yǎng),，培養(yǎng)37℃,，5%CO2
↓
4d換液，以后每天換
四,、實驗操作
1,、 新生小鼠拉頸椎處死，乙醇消毒腿部,，在超凈工作臺內(nèi),，取肌肉于平皿，Hank’s洗3次,，剔除脂肪,、結(jié)締組織，將肌肉標本剪約0.1cm3小塊,；
2,、 將剪碎的肌肉移至離心管，Hank’s洗3次,，靜置1min,，棄去上層液及漂浮組織
3,、 向上述離心管中加入0.25%胰酶，37度水浴消化20min,，每5min搖動或吹打1次離心管,，然后加入生長培養(yǎng)基終止消化；
4,、 反復吹打后,，依次100，200,，400目過篩,，濾液收集后，1000r/min離心10min,；
5,、 棄去清夜，用生長培養(yǎng)基重懸細胞,，懸液加入未經(jīng)PPL包被的培養(yǎng)瓶中,，差速貼壁去除成纖維細胞，37度培養(yǎng)1h后,，轉(zhuǎn)移包被瓶中,，生長培養(yǎng)基培養(yǎng)，4d換液,，以后每天換液1次,。
五、細胞鑒定
1,、顯微鑒定：剛分離出的原代細胞比較小,，呈球形，折光性強,。12h后,，細胞開始貼壁，72h后貼壁*,，細胞逐漸延展成梭形,，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞增殖,、遷移并逐漸規(guī)律性地沿一個方向排列,。當細胞融合80%以上后，開始形成肌管,。
2、免疫細胞化學染色1：肌衛(wèi)星細胞胞漿中含有結(jié)蛋白（desmin）,，可采用鼠抗人及小鼠desmin一抗對衛(wèi)星細胞進行免疫染色鑒定,。
3、免疫細胞化學染色2：采用骨骼肌特異性的肌球蛋白（myosin）單克隆抗體檢測。取含骨骼肌細胞蓋玻片常規(guī)處理后進行myosin的細胞免疫化學染色,，PBS代替一抗做陰性對照,。結(jié)果判定：以細胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色。
六,、注意事項
1,、胰酶消化過程中，也可采用15min兩步消化的方法進行,。根據(jù)所取組織個體年齡決定,，一般成年大小鼠采用兩步消化效果好，幼鼠一步消化和兩步消化差別不大,。
2,、傳代培養(yǎng)代數(shù)不要太多，骨骼肌細胞傳代能力有限,，容易死亡,。
3、骨骼肌細胞培養(yǎng)過程中,，形態(tài)會發(fā)生較大變化,。
4、肌肉組織要盡可能剔除表面的膜和脂肪組織,。
七,、PriCells細胞圖片
