會(huì)員.png)
5
當(dāng)前位置：武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司>>技術(shù)文章>>小鼠真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)
小鼠真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)
PriCells –正常小鼠原代真皮纖維原細(xì)胞培養(yǎng)
一,、實(shí)驗(yàn)試劑
1、培養(yǎng)基： PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement
2,、凍存液： PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO
3,、洗滌液： 1 × PBS （pH 7.4 ）+ 1% P/S
4、染色液： 0.4% Trypan Blue
5,、消化液： PriCells Isolation of Primary Cell Kit
6,、檢測(cè)試劑：抗小鼠Fibronectin抗體，熒光標(biāo)記二抗,，乙醇丙酮混合液（1：1）
二,、實(shí)驗(yàn)器械
1、培養(yǎng)皿
2,、培養(yǎng)瓶
3,、直剪和眼科剪
4、眼科鑷
5,、玻璃滴管
6,、15ml離心管
7、200目網(wǎng)篩
三,、實(shí)驗(yàn)流程
取材
↓
取皮片,，削成厚度為0.5mm的皮片
↓
皮片浸泡在75%酒精中消毒
↓
1 × PBS （pH 7.4 ）清洗皮片兩遍
↓
皮片剪成（3-5）mm×（10-15）mm大小
↓
置于消化液中4℃消化過(guò)夜
↓
剝?nèi)ケ砥ぃ⒐稳フ嫫は碌钠渌M織
↓
將組織塊剪成1mm3左右
↓
加入消化液,，37℃消化至消化液渾濁
↓
停止消化,，懸液過(guò)200目網(wǎng)篩
↓
收集細(xì)胞懸液，800rpm離心5min
↓
重懸細(xì)胞,，重復(fù)離心一次
↓
重懸細(xì)胞,，Trypan Blue染色計(jì)數(shù)，以5×105的數(shù)量接種于培養(yǎng)瓶中
↓
37℃,，5%CO2培養(yǎng)
四,、實(shí)驗(yàn)操作
1、培養(yǎng)瓶預(yù)包被,。試驗(yàn)前一天預(yù)包培養(yǎng)瓶,，置于超靜臺(tái)吹干或45℃烘箱烘干（切記保持無(wú)菌）,，4℃冰箱放置，備用,。
2,、取材：從小鼠身上取皮片，削成厚度為0.5mm左右的皮片,；
3,、材料預(yù)處理：將皮片浸泡在75%的酒精中消毒；用1 × PBS （pH 7.4 ）清洗兩遍（每次約5min）以清除血細(xì)胞,；
4,、初步消化：將皮片剪成（3-5）mm×（10-15）mm大小，去除皮下組織,；將裁剪好的皮塊置于消化液中4℃消化過(guò)夜,；第二天，取出消化好的細(xì)胞,，用鑷子盡可能剝?nèi)ケ砥?，并刮去真皮下的其他組織；
5,、再次消化：處理好后,，將組織塊剪成1mm3左右，加入消化液,，37℃震蕩消化至消化液渾濁（1h左右）,；
6、中止消化：中止酶反應(yīng),，懸液過(guò)200目網(wǎng)篩,；
7、收集重懸細(xì)胞：收集細(xì)胞懸液,，800rpm離心5min,；棄上清，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,，重復(fù)離心一次,；
8、細(xì)胞密度計(jì)數(shù)：培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,，0.4% Trypan Blue染色計(jì)數(shù),，以5×105的數(shù)量接種于培養(yǎng)瓶中。
9,、培養(yǎng)：放置于37℃,，5% CO2培養(yǎng)箱中。
五、細(xì)胞鑒定
1,、顯微鑒定：相差顯微鏡下,，可見細(xì)胞呈梭形或扁的星狀，具有突起,。細(xì)胞具備良好的透光性,。
2、免疫組織化學(xué)鑒定 ：利用Fibronectin相關(guān)抗原檢測(cè),。
3,、細(xì)胞爬片。將洗凈的蓋玻片放入6孔培養(yǎng)板中,，接種細(xì)胞為3×104個(gè)/孔,，48小時(shí)候細(xì)胞可以長(zhǎng)滿，用鑷子取出鋪滿細(xì)胞的蓋玻片備用,。
4、細(xì)胞固定：用PBS洗滌細(xì)胞,，之后放入乙醇丙酮混合液中,，固定10min，空氣中自然干燥,。
5,、特異性抗體：按照說(shuō)明書稀釋比要求稀釋抗體，加入抗體,，放置37℃孵育60min,。
6、洗滌：1 × PBS （pH 7.4 ）洗滌3次 × 15 分鐘,，晾干,。
7、標(biāo)記性抗體：加入熒光標(biāo)記抗體,，37℃孵育30min,。
洗滌：1 × PBS （pH 7.4 ）洗滌3次 × 15 分鐘，晾干,。
8,、封片：封片劑封片。
9,、鏡檢：熒光顯微鏡下觀察,。
六、注意事項(xiàng)
1,、選材注意時(shí)要將皮膚組織上的被毛去除干凈,，也可以使用還未長(zhǎng)出被毛的乳鼠進(jìn)行試驗(yàn)。
2、注意盡量將皮片剪成（3-5）mm ×（10-15）mm大小,，如太大則不利于消化,，太小則不利于真皮、表皮的物理分離,。
3,、過(guò)度消化損傷嚴(yán)重影響成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此應(yīng)嚴(yán)格掌握好酶的消化濃度和消化時(shí)間,。
4,、嚴(yán)格控制成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)條件。包括細(xì)胞培養(yǎng)用液（培養(yǎng)基,，生長(zhǎng)因子,，血清，抗生素）的質(zhì)量,，濃度,。
5、關(guān)于培養(yǎng)瓶包被與否,，有文獻(xiàn)研究顯示包被與未包被之間沒有特別大的差異,。 實(shí)驗(yàn)中，可以酌情考慮是否包被,。
6,、傳代培養(yǎng)細(xì)胞接種量為5×104個(gè)（25 cm2培養(yǎng)瓶），細(xì)胞倍增時(shí)間為48小時(shí),。細(xì)胞傳代培養(yǎng)最佳為4-7代,， 傳代次數(shù)增加，細(xì)胞體積增大,，細(xì)胞之間間隙增加,，細(xì)胞貼壁牢固，傳代消化時(shí)間會(huì)有所延長(zhǎng),。
七,、PriCells細(xì)胞圖片
