二、 使用方法
1 ,、您收到細(xì)胞后，請按照以下方法進行操作：
取出 T25 方瓶， 75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶,，拆下封口膜,，放入 37℃ , 5%CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置 2-3 小時， 以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài),，然后打開瓶子回收瓶子中培養(yǎng)液作為后續(xù)培養(yǎng)此細(xì)胞的培養(yǎng)液（備注： 先使用瓶子中培養(yǎng)液培養(yǎng)及盡快凍存保種細(xì)胞,， 保存種子后再嘗試自己完全培養(yǎng)液培養(yǎng)觀察是否適合此細(xì)胞生長,，以免使用自己培養(yǎng)液不適合細(xì)胞生長造成細(xì)胞狀態(tài)不好或死亡） ,，最后按照后面細(xì)胞傳代步驟進行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。
2 ,、細(xì)胞傳代：
1）細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的 90%面積時，棄 T25 方瓶中的培養(yǎng)液,， 用 PBS 清洗細(xì)胞 3 次,；
2）添加 0.25%消化液約 2ml 至培養(yǎng)瓶中 37 度培養(yǎng)箱放置 3-5 分鐘，倒置顯微鏡下觀察,，待細(xì)胞基本脫落后加入培養(yǎng)基終止消化,，用滴管混勻并將懸液轉(zhuǎn)移至 15ml 離心管中,，1000rpm/min，離心 5min,；
3）棄上清,，沉淀細(xì)胞用 10ml 培養(yǎng)基重懸，然后按 1:2 比例進行分瓶傳代,， 最后放入 37℃ ,5%CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),；
4）待細(xì)胞貼壁后， 觀察培養(yǎng)結(jié)果,，之后進行換液培養(yǎng)或傳代。
3 ,、細(xì)胞凍存：
1）細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的 90%面積時,，棄 T25 方瓶中的培養(yǎng)液,，用 PBS 清洗細(xì)胞 3 次,；
2）添加 0.25%消化液約 2ml 至培養(yǎng)瓶中 37 度培養(yǎng)箱放置 3-5 分鐘，倒置顯微鏡下觀察,，待細(xì)胞基本脫落后加入培養(yǎng)基終止消化,，用滴管混勻并將懸液轉(zhuǎn)移至 15ml 離心管中,，1000rpm/min,，離心 5min；
3）用適當(dāng)量的凍存液（培養(yǎng)液： FBS：DMSO=7:2:1）重懸細(xì)胞,，并放置于凍存管中,；
4）先將細(xì)胞凍存管放置于-20℃ 1h，然后將其移入-80℃過夜,， 24h 后轉(zhuǎn)入液氮中進行長期儲存（或者按照梯度程序降溫模式直接放置-80 度凍存后并轉(zhuǎn)移液氮中長期儲存）,。
4、細(xì)胞復(fù)蘇：
1）從液氮中取出細(xì)胞凍存管（注意：佩戴防爆管面具） ,，快速將其置入 37℃水浴中解凍,， 直至凍存管中無結(jié)晶，然后用 75%的酒精擦拭凍存管外壁,；
2）將凍存管中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含 5ml 培養(yǎng)液無菌離心管中,，1000rpm 離心 5min ，然后加入 5ml 完全培養(yǎng)液混勻細(xì)胞,， 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至 T25 培養(yǎng)瓶中,， 放置于 37℃ , 5%CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
3）第二天,，換用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),。
