一,、小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞簡介 腦微血管內(nèi)皮細胞是血腦屏障的主要組成成分,，能夠限制可溶性物質(zhì)和細胞等從血液進入大腦
一、小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞簡介
腦微血管內(nèi)皮細胞是血腦屏障的主要組成成分,，能夠限制可溶性物質(zhì)和細胞等從血液進入大腦。大腦微血管內(nèi)皮細胞與外周內(nèi)皮細胞相比具有一些相同特性。1）腦微血管內(nèi)皮細胞存在許多細胞間緊密連接,，產(chǎn)生很高的跨內(nèi)皮阻抗，延遲細胞旁的通量,；2）腦微血管內(nèi)皮細胞缺乏內(nèi)皮細胞的窗孔結(jié)構(gòu),，其液相物質(zhì)胞飲水平較低；3）腦微血管內(nèi)皮細胞具有不對稱定位酶和載體介導轉(zhuǎn)運系統(tǒng),，從而產(chǎn)生 “兩極分化"的表現(xiàn)型,。 與外周內(nèi)皮細胞相同，大腦微血管內(nèi)皮細胞表面表達細胞粘附分子,，調(diào)控白細胞進入大腦,。由于微血管內(nèi)皮細胞的器官特異性，內(nèi)皮細胞通常取源于疾病研究的相關(guān)組織,。
本公司生產(chǎn)的小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞采用酶解和密度梯度離心法制備而來,，細胞總量約為5×105/T25方瓶，vWF,、Factor VIII呈陽性,，細胞純度可達90%以上，且不含有HIV-1,、 HBV,、HCV、支原體,、細菌,、酵母和真菌等,。
二、 使用方法
1 ,、您收到細胞后,，請按照以下方法進行操作：
取出 T25 方瓶， 75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶,，拆下封口膜,，放入 37℃ , 5%CO2 細胞培養(yǎng)箱中靜置 2-3 小時， 以穩(wěn)定細胞狀態(tài),，然后打開瓶子回收瓶子中培養(yǎng)液作為后續(xù)培養(yǎng)此細胞的培養(yǎng)液（備注： 先使用瓶子中培養(yǎng)液培養(yǎng)及盡快凍存保種細胞,， 保存種子后再嘗試自己完全培養(yǎng)液培養(yǎng)觀察是否適合此細胞生長，以免使用自己培養(yǎng)液不適合細胞生長造成細胞狀態(tài)不好或死亡） ,，最后按照后面細胞傳代步驟進行細胞傳代培養(yǎng),。
2 、細胞傳代：
1）細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的 90%面積時,，棄 T25 方瓶中的培養(yǎng)液,， 用 PBS 清洗細胞 3 次；
2）添加 0.25%消化液約 2ml 至培養(yǎng)瓶中 37 度培養(yǎng)箱放置 3-5 分鐘,，倒置顯微鏡下觀察,，待細胞基本脫落后加入培養(yǎng)基終止消化，用滴管混勻并將懸液轉(zhuǎn)移至 15ml 離心管中,，1000rpm/min,，離心 5min；
3）棄上清,，沉淀細胞用 10ml 培養(yǎng)基重懸,，然后按 1:2 比例進行分瓶傳代， 最后放入 37℃ ,5%CO2 細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),；
4）待細胞貼壁后,， 觀察培養(yǎng)結(jié)果，之后進行換液培養(yǎng)或傳代,。
3 ,、細胞凍存：
1）細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的 90%面積時，棄 T25 方瓶中的培養(yǎng)液,，用 PBS 清洗細胞 3 次,；
2）添加 0.25%消化液約 2ml 至培養(yǎng)瓶中 37 度培養(yǎng)箱放置 3-5 分鐘，倒置顯微鏡下觀察,，待細胞基本脫落后加入培養(yǎng)基終止消化,，用滴管混勻并將懸液轉(zhuǎn)移至 15ml 離心管中，1000rpm/min,，離心 5min,；
3）用適當量的凍存液（培養(yǎng)液： FBS：DMSO=7:2:1）重懸細胞,，并放置于凍存管中；
4）先將細胞凍存管放置于-20℃ 1h,，然后將其移入-80℃過夜,， 24h 后轉(zhuǎn)入液氮中進行長期儲存（或者按照梯度程序降溫模式直接放置-80 度凍存后并轉(zhuǎn)移液氮中長期儲存）。
4,、細胞復蘇：
1）從液氮中取出細胞凍存管（注意：佩戴防爆管面具） ,，快速將其置入 37℃水浴中解凍， 直至凍存管中無結(jié)晶,，然后用 75%的酒精擦拭凍存管外壁,； 2）將凍存管中的細胞轉(zhuǎn)移至含 5ml 培養(yǎng)液無菌離心管中，1000rpm 離心 5min ,，然后加入 5ml 完全培養(yǎng)液混勻細胞,， 將細胞懸液轉(zhuǎn)移至 T25 培養(yǎng)瓶中， 放置于 37℃ , 5%CO2 細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),；
3）第二天，換用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),。
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