蛋白質(zhì)的定量測定方法：微量凱氏定氮法
【實驗目的】
學習凱氏定氮法的原理和操作技術(shù)。
微量凱氏定氮法【實驗原理】
凱氏定氮法用于測定有機物的含氮量,若蛋白質(zhì)的含氮量已知時,，則可用此法測定樣品中蛋白質(zhì)的含量,。
當?shù)鞍踪|(zhì)與濃硫酸共熱時，其中的碳,、氫兩元素被氧化成二氧化碳和水,，而氮則轉(zhuǎn)變成氨，并進一步與硫酸作用生成硫酸銨,。此過程通常稱為“消化",。但是，這個反應進行得比較緩慢,，通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高反應液的沸點,，并加入硫酸銅作為催化劑，以促進反應的進行,。
消化完成后,，在凱氏定氮儀中加入濃堿，可使消化液中的硫酸銨分解,，游離出氨,，借助水蒸汽蒸餾法，將產(chǎn)生的氨蒸餾到量,、濃度的硼酸溶液中,，硼酸吸收氨后，氨與溶液中氫離子結(jié)合,，使溶液中的氫離子濃度降低,，指示劑顏色改變，然后用標準無機鹽酸滴定,，直至恢復溶液中原來的氫離子濃度為止,。根據(jù)所用標準鹽酸的量可計算出待測物中的總氮量,。
蛋白質(zhì)的含氮量為16%，即1克蛋白質(zhì)中的氮相當于6.25克蛋白質(zhì),，用凱氏定氮法測出的含氮量乘以6.25,即得樣品中蛋白質(zhì)的含量,。
微量凱氏定氮法【實驗材料】
1.實驗器材
微量凱氏定氮儀1套；50ml凱氏燒瓶4個,；移液管,；錐形瓶；試管,；小玻璃珠
2.試驗試劑
(1)濃硫酸,；30％氫氧化鈉溶液；2％硼酸溶液,；標準鹽酸溶液(0.01mol／L),。
(2)粉末硫酸鉀—硫酸銅混合物：K2SO4與CuSO4·5H2O以3：1配比研磨混合。
(3)混合指示劑(田氏指示劑)：由50ml0.1％甲烯藍乙醇溶液與200ml0.1％甲基紅乙醇溶液混合配成,，貯于棕色瓶中備用,。
(4)樣品溶液：配制3mg/ml的牛血清白蛋白溶液作為樣品。
【實驗操作】
1.安裝凱氏定氮儀,。
2.消化：取4個50ml凱氏燒瓶并標號,各加1顆玻璃珠,，在1號及2號瓶中各加樣品1ml，催化劑(K2SO4-CuSO4·5H2O)200mg,，濃硫酸5ml,。注意加樣品時應直接送入瓶底，而不要沾在瓶口和瓶頸上,。在3號及4號瓶中各加1ml蒸餾水和與1,、2號瓶相同量的催化劑和濃硫酸，作為對照,。在通風櫥內(nèi)進行消化,。
在消化開始時應控制火力，不要使液體沖到瓶頸,。待硫酸開始分解并放出SO2白煙后,，適當加強火力，繼續(xù)消化,，直至消化液呈透明淡綠色為止,。撤掉火力，冷卻至室溫,。
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