實(shí)驗(yàn)室對(duì)組織細(xì)胞的破碎方法很多,有機(jī)械方法,、物理方法,、化學(xué)方法和生物化學(xué)方法等。
在破碎前,,材料常需要預(yù)處理,,如動(dòng)物材料要除去與實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)甚至有妨礙的結(jié)締組織,脂肪組織和血污等,,植物種子需要除殼,,微生物材料需將菌體和發(fā)酵液成分分開等。不同實(shí)驗(yàn)規(guī)模,、不同實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)要求,,使用的破碎方法和條件也不同,。一些堅(jiān)韌組織,如肌肉,、植物的根莖等,,常需要強(qiáng)烈的攪拌或研磨作用,,才能把其組織細(xì)胞破壞,。而比較柔軟的組織如肝、腦等,,用普通的玻璃勻漿器即可達(dá)到破壞細(xì)胞的目的,。對(duì)同一實(shí)驗(yàn)材料,由于實(shí)驗(yàn)?zāi)康模ㄒ螅┑牟煌?,采用的破碎方式也存在yi定差異,,如提取中的核酸和提取其中的核苷酸,前者保持溫和的條件,,以保持分子的完整性,;后者可采用強(qiáng)烈手段。
1. 機(jī)械法
主要通過(guò)機(jī)械切力的作用使組織細(xì)胞破碎的方法,,常用的器械有組織搗碎機(jī),、勻漿器、研缽和研磨,、壓榨器等,。
1)組織搗碎機(jī) 一般用于動(dòng)物組織、植物肉質(zhì)種子,、柔嫩的葉芽等,,轉(zhuǎn)速可高達(dá)10000rpm/M以上。由于旋轉(zhuǎn)刀片的機(jī)械切力很大,制備一些較大分子如核酸則很少使用,。
2)勻漿器 勻漿器的研缽磨球和玻璃管內(nèi)壁之間間隙保持在之幾毫米距離,,破碎細(xì)胞的程度比組織搗碎機(jī)高。制作勻漿器的材料,,除玻璃外,,還可以用硬質(zhì)塑料、不銹鋼,、人造熒光樹脂等,。
3)研缽 多用于細(xì)菌或其他堅(jiān)硬植物材料,研磨時(shí)常加入少量石英砂,,玻璃粉或其他研磨劑,,以提高研磨效果。
4)細(xì)菌磨 是一種改良了的研磨器,,比研缽具有更大的研磨面積,,而且低部有出口,。操作時(shí)先把細(xì)菌和研磨粉調(diào)成糊狀,每次加入一小勺,,研磨20-30秒即可將細(xì)菌細(xì)胞磨碎,。
2. 物理法
主要通過(guò)各種物理因素使組織細(xì)胞破碎的方法。在生化制備中常用的方法有:
1)反復(fù)凍溶法 先將樣品深冷至-15---20度使之凍固,,再緩慢的融化,,反復(fù)多次,多用于動(dòng)物性材料,。
2)急熱驟冷法 將材料投入沸水中,,維持85-90分鐘,至水浴中急速冷卻,,此法可用于細(xì)菌及病毒材料,。
3)超聲波處理 頻率一般選在10KC至200KC,功率200-500瓦范圍,,處理時(shí)間有數(shù)分鐘至數(shù)鐘不等,,處理過(guò)程中注意冷卻。此法多用于微生物材料,。
3.化學(xué)及生物化學(xué)法
有自溶法,,酶解法和表面活性劑法等。
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