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常規(guī)普通PCR常見(jiàn)問(wèn)題
閱讀：2151 發(fā)布時(shí)間：2022-7-4
1.瓊脂糖凝膠電泳后無(wú)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶
主要表現(xiàn)：Marker及對(duì)照條帶均正常,，但檢測(cè)樣本無(wú)條帶。
原因分析：1.反應(yīng)條件不合適：PCR過(guò)程中退火溫度過(guò)高,，退火延伸時(shí)間不足,，反應(yīng)循環(huán)數(shù)過(guò)少。
2.核酸模板濃度或純度低：普通PCR的檢測(cè)敏感度有限,，樣本核酸含量低或者含有抑制物,。
3.反應(yīng)體系與核酸擴(kuò)增不匹配：檢測(cè)體系中的Mg2+濃度,，dNTPs量或Buffer與目標(biāo)核酸擴(kuò)增所需條件不匹配。
4.引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解：存在引物二聚體或二級(jí)結(jié)構(gòu),，引物稀釋后未分裝儲(chǔ)存條件不適宜或者反復(fù)凍融次數(shù)過(guò)多,。
解決方案：1.優(yōu)化反應(yīng)條件，梯度摸索退火溫度,，延長(zhǎng)退火延伸時(shí)間,，增加反應(yīng)循環(huán)數(shù)（30-45區(qū)間為宜）。
2.對(duì)核酸模板進(jìn)行純化,，或使用商業(yè)化核酸提取試劑盒進(jìn)行提取,，增加核酸模板的上樣量。
3.優(yōu)化反應(yīng)體系（預(yù)混體系除外）,，改變檢測(cè)體系中的Mg2+濃度及dNTPs用量,，更換體系中Buffer。
4.重新設(shè)計(jì)引物,，避免引物二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu),，在一次稀釋引物后可分裝成多支小管，減少反復(fù)凍融次數(shù),。