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退火溫度對微滴式數(shù)字PCR儀的影響
閱讀：3557 發(fā)布時間：2021-8-30
微滴式數(shù)字PCR儀熱循環(huán)程序的主體是變性-退火（復(fù)性）-延伸三個溫控步驟的循環(huán)。無論是常規(guī)PCR,、熒光定量PCR還是數(shù)字PCR退火溫度是反應(yīng)特異性最關(guān)鍵的參數(shù)之一,。
微滴式數(shù)字PCR儀退火溫度設(shè)置得太低可能導(dǎo)致非特異性PCR產(chǎn)物的擴增,；退火溫度過高可能會降低PCR擴增效率，降低目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量,。
微滴式數(shù)字PCR儀理想的退火溫度跟多個因素有關(guān),。要找到理想的Ta溫度，需要嘗試不同的溫度下重復(fù)測試相同的反應(yīng)體系,，這需要耗費更多時間和試劑耗材,。
其實與經(jīng)典PCR反應(yīng)一樣，使用具有溫度梯度功能的熱循環(huán)儀可以很容易地確定微滴式數(shù)字PCR反應(yīng)體系理想的退火溫度,，在一次實驗中即可同時測試8個不同退火溫度,，以篩選出理想的溫度條件。
所謂溫度梯度,，即在標(biāo)準(zhǔn)的96孔PCR儀中,，各行/列在同一個溫度步驟中產(chǎn)生不同的溫度。在一次運行中即可考察不同溫度對PCR擴增效果的影響,，極大地減少實驗次數(shù),，避免重復(fù)實驗產(chǎn)生的不確定因素造成的影響。
對于某些難度更大的稀有突變檢測實驗中,，由于野生型背景的干擾以及引物探針設(shè)計困難,，很可能出現(xiàn)非特異性擴增。這時ddPCR體系的退火溫度不僅要確保陽性微滴和陰性微滴的區(qū)分,，還要確保僅發(fā)生非特異性的微滴與特異性擴增的微滴明確分開,。
在沒有溫度梯度功能加持的情況下，相同的數(shù)字PCR體系優(yōu)化和構(gòu)建可能需要經(jīng)過十?dāng)?shù)次重復(fù)實驗來測試不同退火溫度條件下的實驗效果,。此外也需要指出,，并非所有的數(shù)字PCR技術(shù)都能通過溫度梯度的方式優(yōu)化檢測體系，目前僅兼容標(biāo)準(zhǔn)PCR熱循環(huán)儀的數(shù)字PCR平臺才能使用溫度梯度熱循環(huán)程序。溫度梯度功能是快速優(yōu)化,、構(gòu)建數(shù)字PCR反應(yīng)體系的利器,，能大大減少體系優(yōu)化階段數(shù)字PCR試劑耗材的額外消耗，縮短工作時間,，快速取得理想的實驗結(jié)果,。