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Annexin V-PI染色凋亡試劑盒是一種鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸PS有高度親和力,，可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的PS與凋亡早期細(xì)胞胞膜結(jié)合,，將Annexin V標(biāo)記熒光染料EGFP利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

原理：
磷脂酰絲氨酸（PS）在正常細(xì)胞中只存在于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè),，而在凋亡早期,，PS由細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)外翻至細(xì)胞膜外側(cè)。AnnexinⅤ是一種分子量為35-36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白,，能與PS特異性結(jié)合,。AnnexinⅤ經(jīng)過FITC、EGFP或PE標(biāo)記后,，作為熒光探針,，即可通過PS特異性結(jié)合從而特異性標(biāo)記凋亡早期細(xì)胞,。

Propidium iodide（PI）是一種核酸染料，但其不能通過活細(xì)胞的完整細(xì)胞膜,，只能通過凋亡晚期和死細(xì)胞的細(xì)胞膜,，因此只能用來標(biāo)記凋亡晚期細(xì)胞和死細(xì)胞。

通過AnnexinⅤ與PI聯(lián)合標(biāo)記,，再經(jīng)流式細(xì)胞儀或者熒光顯微鏡檢測(cè),，就可以確定細(xì)胞是活細(xì)胞、凋亡早期細(xì)胞還是凋亡晚期細(xì)胞或者死細(xì)胞,。

試劑盒組成
A液（Annexin V-EGFP）,、B液（PI溶液）、Binding Buffer

實(shí)驗(yàn)步驟：
1. 懸浮細(xì)胞處理：收集細(xì)胞懸液,，900rpm 3min離心去除培養(yǎng)基后用PBS潤(rùn)洗2次,，再用Binding Buffer將細(xì)胞重懸為1x106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。
貼壁細(xì)胞處理：將細(xì)胞消化下來吹散后,，離心去除胰酶及培養(yǎng)基后用PBS潤(rùn)洗2次,，再用Binding Buffer將細(xì)胞重懸為1x106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。
2. 取100ul細(xì)胞懸液加入5ul A液與5ul B液,，混勻后避光孵育10min,。
3. 用熒光顯微鏡或者流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。

注意事項(xiàng)：
1. 必須使用活細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè),，不能使用破壞細(xì)胞膜完整性的試劑處理細(xì)胞,。
2. 普遍認(rèn)為PI有潛在致癌風(fēng)險(xiǎn)，操作時(shí)注意戴手套操作,，避免交叉污染,。
3. 孵育結(jié)束后，應(yīng)盡量在1h以內(nèi)檢測(cè)結(jié)果,，否則結(jié)果可能出現(xiàn)異常,。
4. 細(xì)胞經(jīng)過消化、離心,、清洗后可能會(huì)出現(xiàn)凋亡增多的情況,，因此必須注意操作盡量輕柔，離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間盡量低,，尤其是貼壁細(xì)胞不要消化時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致細(xì)胞提前進(jìn)入凋亡,。
5. AnnexinⅤ是Ca2+依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，因此消化細(xì)胞時(shí)盡量不要使用含EDTA的消化液,，PBS也不要含EDTA等螯合劑,。
6. 使用熒光顯微鏡檢測(cè)時(shí)，可以將貼壁細(xì)胞直接接種在玻片上，實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行清洗染色后直接在玻片上觀察細(xì)胞,，避免消化損失細(xì)胞導(dǎo)致凋亡率增加,。
使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞時(shí)，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要設(shè)置陰性對(duì)照（未染色）,、單染對(duì)照（Annexin V-EGFP,、PI分別單染）以調(diào)整熒光補(bǔ)償去除光譜重疊，同時(shí)根據(jù)未處理細(xì)胞空白對(duì)照和經(jīng)Annexin V,、PI分別細(xì)胞染色后的單染對(duì)照的分析設(shè)定十字門的位置,。

熒光顯微鏡下檢測(cè)效果