各位奮戰(zhàn)在科研前線的戰(zhàn)友們,，你們是否曾在凌晨三點的細胞房里,，在顯微鏡下盯著細胞培養(yǎng)瓶里可疑的那些小黑點，糾結這到底是細胞碎片還是污染,，這細胞還能做實驗嗎,？事實上，細胞碎片和微生物污染都有其明顯的特征,，了解這些特征,，我們就能夠簡單有效地將它們區(qū)分開。
01
細胞內(nèi)黑點和細胞外黑點的區(qū)分
細胞內(nèi)黑點：首先需要明確的是,，細胞內(nèi)的黑色顆粒既不是碎片也不是污染,，是細胞器及細胞外分泌泡，屬于細胞自身的結構及特性,。不同類型的細胞,，胞內(nèi)顆粒的數(shù)量可能不同。培養(yǎng)條件也會影響細胞內(nèi)顆粒的數(shù)量,。
▲ 細胞內(nèi)黑色顆粒為自身結構特性
細胞外黑點：通常為細胞碎片,、細胞代謝產(chǎn)物或血清中的磷酸鈣沉淀（此文中統(tǒng)稱為碎片），常常與污染混淆,。
02
常見的細胞培養(yǎng)微生物污染類型
最常見的微生物污染為細菌,、真菌、支原體污染,。真菌與碎片差別很大,，真菌通常為白色圓球狀或白色菌絲狀，碎片是小黑點,，不難區(qū)分,。
▲ 真菌污染的兩種典型特征
而支原體用光學顯微鏡是看不見的，必須要用PCR等實驗手段進行檢測,。在此不做贅述,。
然而，細菌（特別是球狀細菌）與碎片卻極為相似,，顯微鏡下呈現(xiàn)為小黑點,，分布于細胞周圍。區(qū)分細菌和碎片則是此文的重點,。
03
從形態(tài),、運動和增殖特點區(qū)分碎片和細菌
4倍或10倍物鏡觀察，可以初步判斷黑點分布情況，但看不清形態(tài),，不容易判斷,。所以我們首先要將物鏡調(diào)到20或40倍，再進一步觀察黑點的特征,。主要從三個方面來判斷：1. 形態(tài)特點 2. 運動方式 3. 是否增殖,。
● 看形態(tài)
碎片通常是不規(guī)則的，有圓形有多邊形,，大小不一,，分布不均勻。細菌形態(tài)規(guī)則,，呈桿狀,、球狀或線狀，具有高度重復性,，分布較為均勻,。
▲ 左：細胞碎片 右： 細菌污染
● 看運動
碎片可分為貼壁或懸浮兩種狀態(tài)：貼壁的碎片不會自主運動，而懸浮的細胞碎片會隨液體輕微震動或緩慢飄動（越小的碎片越容易震動,，震動頻率越高）,。
細胞碎片或分泌物是細胞在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的，正常培養(yǎng)過程中細胞代謝和死亡無可避免,，大多細胞系都會有類似情況,，只是不同細胞系碎片顆粒多少會有區(qū)別。顆粒會動是基于高中時期所學基本物理原理-布朗運動,，根據(jù)其他細胞庫細胞照片情況,，只要拍攝比較清晰的，都可以看到細胞外黑色顆粒,這些碎片只要是懸浮在液體里都會做布朗運動,。JCRB細胞庫延時攝影信息可以更明顯觀測到碎片位置變化,，是布朗運動的時間積累結果。
▲ 細胞生長延時攝影（來源：JCRB細胞庫）
細菌不會貼壁,，無鞭毛的細菌不會運動；有鞭毛的細菌會定向游動,、原地打轉,、震動，細菌這幾種運動方式經(jīng)常是同時存在的,。細菌相比于碎片,，運動速度要快得多，運動幅度也會更大,。
▲ 碎片隨著液體輕微震動
▲ 細菌快速運動
● 看增殖
碎片不會增殖，但細胞逐漸死亡或細胞密度增大,，碎片都會逐漸增多,。隨著培養(yǎng)時間延長，培養(yǎng)基中的血清也會緩慢析出沉淀,，導致黑點變多,。但培養(yǎng)基不會渾濁。
現(xiàn)在我們大部分時候培養(yǎng)細胞都會加1%青鏈霉素雙抗（也稱為P/S）預防細菌污染,，然而有一些細菌不在P/S抗菌譜中，一旦落入培養(yǎng)基就會開始增殖,。
大部分細菌會在1-2天內(nèi)爆發(fā)式生長,，導致培養(yǎng)基渾濁，肉眼可見流沙狀物質,。
也有少數(shù)種類細菌會受到雙抗的影響,，增殖速度沒那么快。當比較難判斷的時候,，我們可以使用不含雙抗的培養(yǎng)基過夜培養(yǎng),，觀察黑點的增殖情況。
▲ 細菌污染導致培養(yǎng)基渾濁
04
涂平板菌檢
如果通過以上三種方法還是難以判斷,，還有一招——將培養(yǎng)上清涂布細菌培養(yǎng)平板進行驗證：取細胞培養(yǎng)上清,，無菌環(huán)境下涂布細菌專用的固體培養(yǎng)基平板，置于生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-72h,，觀察是否產(chǎn)生菌落,。此方法更準確，但要求實驗室有微生物培養(yǎng)設備和材料,，同學們可以根據(jù)自己的實際情況選擇合適的方法,。
▲ LB平板菌檢（左：陽性 右：陰性）
總之，面對細胞中的小黑點,，我們無需過分恐慌,。只要我們深入了解細胞碎片與微生物污染的特征，并掌握正確的判斷方法,，便能輕松應對,。
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